水藥酢漿草對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)性研究

陳應(yīng)康，羅國忠，田培燕，葉勁松，楊小軍

水藥酢漿草對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)性研究

陳應(yīng)康1，羅國忠2，田培燕3，葉勁松1，楊小軍1

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，貴州都勻558000；2.貴州省黔南州中醫(yī)院病理科，貴州都勻558000；3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理教研室，貴州都勻558000）

目的探討水藥酢漿草對四氯化碳CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法將40只小鼠隨機(jī)分為5組，正常組、CCl4模型組、酢漿草低、中、高劑量組，每組8只。正常組和CCl4模型組給予生理氯化鈉溶液，酢漿草低、中、高劑量組給分別給100、300及600 mg/kg酢漿草灌胃，連續(xù)5 d。于末次給藥2 h后，除正常組外，其余各組小鼠給予0.3%CCl4花生油溶液稀釋、按0.02 ml/g的劑量皮下注射，在中毒后16 h取血和肝臟組織，分別檢測各組小鼠肝功能相關(guān)的生化指標(biāo)。結(jié)果與CCl4模型組小鼠比較，不同劑量酢漿草治療組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST及TNF-α水平不同程度降低（P＜0.05）；肝組織中CAT、GSH及SOD水平不同程度升高（P＜0.05），MDA水平不同程度降低（P＜0.05）。結(jié)論水藥酢漿草對CCl4所致小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與酢漿草降低氧化酶活性和抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

酢漿草；四氯化碳；肝損傷

水族是源于古代“百越”族系，其通過長期與惡劣的自然環(huán)境和疾病的斗爭中積累疾病防治的豐富經(jīng)驗(yàn)，水族醫(yī)藥是結(jié)合中醫(yī)及貴州苗族、布依族等多種少數(shù)民族醫(yī)藥特點(diǎn)所形成，具有云貴高原藥物學(xué)特點(diǎn)和民族特色的醫(yī)藥體系。酢漿草是酢漿草科植物酢漿草的全草，其性涼味酸，具有清熱解毒、抗炎利尿、清肺化痰的功效，且致死劑量較高，毒性較小。研究報(bào)道酢漿草有一定的肝臟保護(hù)作用，其活性成分提取物能有效地降低肝損傷小鼠血液紅細(xì)胞中一氧化氮的含量以達(dá)到抗氧化的作用。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是經(jīng)典的急性肝損傷造模化學(xué)物質(zhì)，其在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活后，產(chǎn)生大量自由基及造成脂質(zhì)過氧化，對肝臟產(chǎn)生損害作用。為探討酢漿草對肝臟的保護(hù)作用，本研究采用CCl4建立小鼠急性肝損傷模型，探討不同劑量酢漿草對CCl4所致急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級6～8周齡雌性昆明小鼠，平均體重為（20.4±2.7）g，采購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。在26℃室溫，70%濕度及12 h交替照明的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與儀器

將酢漿草干燥全草使用粉碎機(jī)中度粉碎，稱取100 g，加入蒸餾水1 000 ml，經(jīng)浸泡30 min、加熱、過濾、50℃水浴揮干、真空干燥等步驟，得到酢漿草水提取物18.0 g，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。四氯化碳CCl4（購自北京化工廠，生產(chǎn)批號(hào)：20131029）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，丙二醛（MDA）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子（TNF-α）放射免疫試劑盒購自上海博宏生物科技有限公司。主要儀器：全自動(dòng)生化分析儀（日立7070型，日本），酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國），離心機(jī)（LDZ-52型，北京離心機(jī)廠）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

將40只小鼠飼養(yǎng)至10周時(shí)，平均分成5組：正常組、CCl4模型組、低劑量酢漿草組、中劑量酢漿草組及高劑量酢漿草組，每組8只。酢漿草低、中、高劑量組均按100 mg/kg、300 mg/kg及600 mg/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d；正常組和CCl4模型組灌胃給予等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)5 d。末次給藥后2 h，除正常組外，其余各組小鼠給予0.3%CCl4（花生油溶液稀釋）、按0.02 ml/g的劑量皮下注射。禁食不禁水，16 h后稱體重，乙醚麻醉后，摘眼球采血；然后處死小鼠，迅速取出肝臟備檢。

1.4標(biāo)本收集及檢測

待采取的血液充分凝固，在4℃下，3 000 r/min，離心10 min分離血清，用于檢測ALT、AST。各組小鼠的肝臟組織采用4℃生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干水分，稱取肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝臟指數(shù)（即肝臟重量占體重的百分比）。取小鼠肝臟最大的肝葉稱取重量，加入9倍4℃生理鹽水，用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿10 min，然后于4℃下，3 000 r/min，離心15 min，取上清液測定肝組織勻漿中CAT、GSH、SOD及MDA的含量，具體操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示。多組間正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料比較用單因素方差分析（ANOVA），采用LSD進(jìn)行組間均數(shù)的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1酢漿草對CCl4致肝損傷的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

根據(jù)體重及肝臟重量結(jié)果顯示，各組小鼠平均體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CCl4模型組小鼠肝臟重量較其他各組顯著增加（P＜0.05）。與CCl4模型組比較，不同劑量酢漿草組小鼠肝臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），隨著劑量的增大肝臟指數(shù)逐漸下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2酢漿草對CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平的影響

CCl4模型組小鼠較正常組小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。與CCl4模型組比較，不同酢漿草劑量組小鼠血清ALT、AST及TNF -α水平均顯著降低（P＜0.05），且高劑量酢漿草組小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平升高程度高于低劑量組，見表2。

表1　酢漿草對CCl4致肝損傷的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（n=8±s）

表1　酢漿草對CCl4致肝損傷的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（n=8±s）

注：?與CCl4模型組比較，P＜0.05

組別體重/g肝臟質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/%正常組23.9±2.81.24±0.28?5.45±0.32?CCl4模型組23.2±3.11.63±0.316.92±0.51低劑量酢漿草組23.4±2.71.34±0.41?5.94±0.53?中劑量酢漿草組23.8±2.91.28±0.29?5.78±0.55?高劑量酢漿草組22.9±2.51.26±0.30?5.61±0.49?

表2　酢漿草對CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平的影響（n=8±s）

表2　酢漿草對CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST及TNF-α水平的影響（n=8±s）

注：1）與CCl4模型組比較，P＜0.05；2）與低劑量酢漿草組比較，P＜0.05

組別ALT/（u/L）AST/（u/L）TNF-α/（pg/ml）正常組38.5±18.91）139.1±46.31）98.7±11.91）CCl4模型組309.6±98.2452.5±102.4213.4±32.1低劑量酢漿草組168.2±49.21）289.0±59.31）183.5±22.91）中劑量酢漿草組126.7±44.11）2）247.3±53.81）168.4±24.31）高劑量酢漿草組102.3±34.21）2）189.2±48.41）2）128.6±19.21）2）

2.3酢漿草對CCl4致肝損傷小鼠肝組織CAT、GSH、SOD及MDA的影響

與正常組比較，CCl4模型組小鼠肝臟組織中CAT、GSH、SOD水平顯著降低（P＜0.05），MDA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與CCl4模型組比較，不同酢漿草劑量組小鼠肝臟組織CAT、GSH和SOD水平顯著升高（P＜0.05），MDA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴性，見表3。

表3　酢漿草對CCl4至肝損傷小鼠肝組織CAT、GSH、SOD及MDA的影響（n=8±s）

表3　酢漿草對CCl4至肝損傷小鼠肝組織CAT、GSH、SOD及MDA的影響（n=8±s）

注：1）與CCl4模型組比較，P＜0.05；2）與低劑量酢漿草組比較，P＜0.05

組別CAT/（u/mg）GSH/（u/mg）SOD/（u/mg）MDA/（nmol/g）正常組35.4±6.11）285.6±49.61）234.6±17.91）0.82±0.191）CCl4模型組18.5±4.9187.3±40.7157.3±16.12.43±0.54低劑量酢漿草組23.5±5.11）223.1±38.31）181.5±14.61）1.68±0.351）中劑量酢漿草組27.4±5.31）241.9±43.11）188.7±18.51）1.41±0.281）高劑量酢漿草組32.7±5.71）2）264.2±37.41）2）198.4±21.31）2）1.13±0.321）2）

3 討論

將化學(xué)物質(zhì)、藥物、生物學(xué)制劑等注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)肝損傷是建立動(dòng)物肝損傷模型的常用方法。其中CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是目前對保肝藥物的作用及機(jī)制研究時(shí)最常用的病理模型，CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的機(jī)制主要與自由基及活性氧化產(chǎn)物的大量生成，過量的自由基可迅速攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，其次自由基干擾細(xì)胞蛋白和核酸的合成，引起細(xì)胞中毒死亡。本研究采用單次皮下注射CCl4建立肝損傷模型，觀察酢漿草對肝損傷的保護(hù)作用。

目前隨著對中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)深入研究，中醫(yī)藥逐漸應(yīng)用于急救醫(yī)學(xué)的臨床實(shí)踐中。酢漿草是貴州省水族族習(xí)用藥材，具有清熱解毒、抗炎利尿等作用，常用于治療急性肝炎及急性黃疸，其對酒精肝大鼠模型有一定的治療作用，但其機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道酢漿草在35～1 120 mg/kg的劑量范圍內(nèi)各組小鼠活動(dòng)正常，其最大致死劑量大于1 120 mg/kg。本研究將不同劑量的酢漿草應(yīng)用于小鼠肝損傷模型，比較其治療效果。ALT和AST是有肝細(xì)胞膜受損時(shí)，釋放入血，其水平含量是反映肝損傷的敏感且最常用的指標(biāo)。TNF-α是重要的炎癥因子，CCl4誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)病過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，與CCL4模型組比較，正常組小鼠血清肝臟指數(shù)、ALT、AST及TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。表明模型建立成功。不同酢漿草劑量組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST及TNF-α水平均有不同程度的降低（P＜0.05），提示酢漿草對CCl4引起的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，高劑量組的保護(hù)效果優(yōu)于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

CAT和GSH的主要作用是催化過氧化氫分解，SOD是體內(nèi)重要的自由基清除劑，這3者是體內(nèi)主要的抗氧化酶，可激活或調(diào)動(dòng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，其表達(dá)水平對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可反映機(jī)體清除自由基和抗氧化的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可進(jìn)一步與生物大分子結(jié)合形成加醛復(fù)合物，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，其表達(dá)水平可間接反映機(jī)體組織或細(xì)胞受自由基攻擊和損傷的嚴(yán)重程度。本研究中，與正常組比較，CCl4模型組小鼠肝臟組織中CAT、GSH、SOD水平顯著降低（P＜0.05），MDA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。表明CCl4誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制與機(jī)體抗氧化酶活性降低和脂質(zhì)過氧化作用等有關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。與CCl4模型組比較，不同酢漿草劑量組小鼠肝臟組織CAT、GSH和SOD水平顯著升高（P＜0.05）MDA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴性。表明酢漿草可降低肝臟CAT、GSH和SOD等抗氧化酶的表達(dá)水平，提高機(jī)體抗氧化和清除氧自由基的能力，從而抑制脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的啟動(dòng)，減少M(fèi)DA在體內(nèi)的積累，達(dá)到減輕CCl4對小鼠肝臟造成的損傷。

綜上所述，酢漿草能夠減輕CCl4所致的小鼠肝損傷，降低血清ALT、AST及TNF-α水平，降低肝損傷小鼠肝臟組織中CAT、GSH和SOD的表達(dá)水平，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。因此，本研究認(rèn)為酢漿草對CCl4所致的性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與其能夠提高機(jī)體清除自由基能力和增強(qiáng)抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。但本研究僅為前期的觀察實(shí)驗(yàn)，在未來的研究中可結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)對酢漿草肝臟保護(hù)作用的具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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（張蕾編輯）

Protective effect of Shui ethnic medicine oxalis corniculata on liver injured by carbon tetrachloride in mice

Ying-kang CHEN1，Guo-zhong LUO2，Pei-yan TIAN3，Jin-song YE1，Xiao-jun YANG1
（1.Department of Pathology，South Guizhou Medical College，Tuyun，Guizhou 558000，P.R. China；2.Department of Pathology，Qiannan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Tuyun，Guizhou 558000，P.R.China；3.Department of Physiology，South Guizhou Medical College，Tuyun，Guizhou 558000，P.R.China）

【Objective】To investigate the liver protective effect of Shui ethnic medicine oxalis corniculata on hepatic injury induced by carbon tetrachloride（CCl4）in mice.【Methods】Forty mice were randomly divided into normal group，CCl4model group，low-dose oxalis corniculata group，medium-dose oxalis corniculata group and high-dose oxalis corniculata group with 8 in each group.Normal group and CCl4model group were given normal saline；low-，medium-and high-dose oxalis corniculata groups were orally given 100，300 and 600 mg/kg oxalis corniculata respectively for 5 consecutive days.Except the normal group，other groups were given 0.3%CCl4（diluted with peanut oil solution）subcutaneously at a 0.02 ml/g dose 2 h after the last administration. Blood and liver tissue were collected 16 h later to detect biochemical indicators related to liver function.【Results】Compared with the CCl4model group，serum ALT，AST and TNF-α levels in the oxalis corniculata groups decreased（P＜0.05）；the levels of CAT，GSH and SOD significantly increased and the content of MDA remarkably reduced to different extent in liver homogenate of the oxalis corniculata groups（P＜0.05）.【Conclusions】Shui ethnic medicine oxalis corniculata has a good liver protective effect on the hepatic injury induced by CCl4in mice，and the mechanism is probably related with the decrease of liver anti-oxidative enzyme activities and the anti-lipid-peroxidation effect.

oxalis corniculata；carbon tetrachloride；liver injury

R-332

A

1005-8982（2015）36-0012-04

2015-08-14