高效液相色譜法柱后衍生法測定陳皮中黃曲霉毒素

魏瑩，李文東，楊蘭，李紅君，陳光華，劉福

（1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000）

高效液相色譜法柱后衍生法測定陳皮中黃曲霉毒素

魏瑩1，李文東2，楊蘭1，李紅君2，陳光華2，劉福2

（1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000）

目的考察醫(yī)院藥房中不同批次陳皮飲片中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，為確保陳皮飲片的臨床用藥安全。方法采用高效液相色譜法（HPLC）-碘柱后衍生化-熒光檢測方法測定陳皮樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速為0.8mL/min，熒光檢測，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm。柱后碘衍生化系統(tǒng)為衍生溶液為0.05%的碘溶液，流速為0.3mL/min，衍生化反應(yīng)器溫度為70℃。結(jié)果藥房現(xiàn)存5批次陳皮樣品均未檢出黃曲霉毒素；黃曲霉毒素G2，G1，B1，B2進(jìn)樣量分別在108～1 085 ng，217～2 171 ng，191～1 913 ng，64～644 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率在60%～110%之間。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、可靠，可作為陳皮中黃曲霉毒素的含量測定方法。

黃曲霉毒素；陳皮；碘柱后衍生化；免疫親和柱；高效液相色譜法

黃曲霉毒素（AFT）被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為Ⅰ類致癌物質(zhì)，主要是由黃色曲霉菌和寄生的曲霉菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物［1-2］。黃曲霉毒素主要有B1，B2，G1，G24種，其中黃曲霉毒素B2毒性最強(qiáng)［3］。中藥材在采收貯存加工和炮制過程處理不當(dāng)，容易滋生霉菌并被其產(chǎn)生的黃曲霉毒素所污染［4-5］。陳皮作為傳統(tǒng)中藥，來源于蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效［6］，主要用于治療胸腹脹滿、痰多咳嗽、消化不良以及惡心嘔吐等癥［7-9］。但陳皮在加工儲存過程中，由于溫度和濕度等環(huán)境影響，很容易霉變而產(chǎn)生如黃曲霉等真菌，這些微生物代謝從而產(chǎn)生黃曲霉毒素。陳皮陳列在醫(yī)院藥房的藥斗內(nèi)，由于四川空氣潮濕且藥斗的密閉性較差，故陳皮在此過程很容易受潮霉變。筆者為確保陳皮飲片的臨床用藥安全，采用免疫親和柱凈化樣品后高效液相色譜法（HPLC）-柱后碘衍生化-熒光檢測方法對本院藥房中不同批次陳皮中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2進(jìn)行了含量測定，現(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀（Agilent 1260四元泵、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站）；Agilent1200型熒光檢測器；Vector PCX衍生化儀；78-1磁力加熱攪拌器（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；瑞士Mettle AE240型電子天平（萬分之一）；AflaStar FIT黃曲霉毒素總量免疫親合柱（1mL）。黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（國家食品藥品鑒定研究院，批號610001-201301，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2質(zhì)量濃度分別為1.04，0.35，1.18，0.59μg/mL）。甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。陳皮飲片購于四川省中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)楊武亮教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑Citrisreticulata Chachi的干燥成熟果皮。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；熒光檢測激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm；進(jìn)樣量：20μL。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

2.2柱后碘衍生化

以0.05%的碘溶液為衍生溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100mL使溶解，用水稀釋定容至1 000mL，即得），流速為0.3mL/min，衍生化反應(yīng)溫度為70℃。

2.3溶液制備

精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品0.92mL，置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，制成混合對照品貯備液，其中含黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)量濃度分別為95.68，32.2，108.56，54.28 ng/mL。取陳皮粉末約5 g（過2號篩），精密稱定，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75mL，震蕩30min（速度160 r/min），靜置30min后，精密吸取上清液15mL，置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過。量取續(xù)濾液20mL，通過免疫親合柱（流速3mL/min），用水20mL洗脫（流速3mL/min），洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用1.5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，即得供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品貯備液2，4，8，16，20μL進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，pg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的線性回歸方程分別為：Y=0.05X+1.2（r=0.999 5）；Y= 0.105X+0.43（r=0.999 9）；Y=0.037X+0.09（r=0.999 9）；Y=0.05X+0.01（r=0.999 8），其線性范圍分別是191～1 913 ng，64～644 ng，217～2 171 ng，108～1 085 ng。

精密度試驗：精密吸取同一混合對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果以黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的峰面積計算的RSD分別為0.7%，0.6%，2.0%，0.7%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：按2.3項下方法，制備供試品溶液，精密加入混合對照品溶液0.5 mL，在上述色譜方法下，分別于0，2，4，8，12 h時進(jìn)樣。結(jié)果以黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的峰面積計算RSD分別為0.2%，0.4%，0.2%，0.2%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：按2.3項下方法，平行制備供試品溶液5份，分別精密加入混合對照品貯備液0.5mL，在上述色譜方法下進(jìn)樣分析。結(jié)果黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2峰面積的RSD分別為0.2%，0.4%，0.2%，0.2%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

檢測限和定量限確定：倍比稀釋一混合對照品溶液，在信噪比為3時，測得黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢測限分別為143.52，96.6，162.84，81.42 ng；在信噪比為10時，測得黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的定量限分別為382.72，128.80，434.24，217.12 ng。

加樣回收試驗：取陳皮粉末5 g，共6份，分別加入混合對照品溶液0.5mL（即相當(dāng)于10.0μg/kg），在上述色譜方法下進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。與文獻(xiàn)［10］提示，當(dāng)添加濃度在1～10μg/kg時，回收率范圍為60%～115%相符。

表1　加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.5樣品含量測定

取5批樣品（批號分別為130304，140120，140324，140415，140611），精密吸取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，由回歸方程計算出樣品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的量，結(jié)果，5個批次的樣品中均未檢測到G2，G1，B2，B1。

3　討論

本院藥房5個批次的陳皮飲片樣品均未檢出黃曲霉毒素。本院藥房各批次陳皮飲片從生產(chǎn)到藥房流通時間是1～2年，均有不同程度的受潮，但均未霉變，即未產(chǎn)生黃曲霉毒素。但鑒于黃曲霉毒素的危害極大，陳皮藥材在臨床入藥是都應(yīng)該進(jìn)行必要的安全性評價，保證陳皮臨床安全用藥。免疫親和凈化HPLC-柱后碘衍生化-熒光檢測法具有方法簡便、衍生反應(yīng)穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為陳皮中黃曲霉毒素的含量測定方法。

［1］Elisabete YS，Mario A，F(xiàn)abia Y，etal.Evluation of fumonisin-aflatoxin cooccurrence in Brazilian corn hybrids by ELISA［J］.Food Addit Contam，2001，18（8）：719-729.

［2］趙飛，焦彥朝，連賓，等.黃曲霉毒素檢測方法的研究進(jìn)展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：123-126.

［3］郝愛魚，趙麗元，劉英慧，等.HPLC柱后光衍生熒光法測定中藥飲片中黃曲霉毒素殘留量［J］.藥物分析雜志，2012，32（12）：2 203-2207.

［4］栗建明，李純，顧利紅，等.高效液相色譜柱后衍生法測定果實(shí)類藥材中的黃曲霉毒素［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，7（22）：461-464.

［5］吳瓊.改進(jìn)飲片加工包裝及貯藏保管的探討［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010（3）：86-87.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：191.

［7］官福蘭，王如俊，王建華.陳皮及橙皮苷對離體腸管運(yùn)動的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2002（2）：65-67.

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［9］李紅芳，李丹明，瞿頌義，等.枳實(shí)和陳皮對兔離體主動脈平滑肌條作用機(jī)理探討［J］.中成藥，2001，23（9）：658-660.

［10］Codex Alimentarius Commission ProceduralManual（Twentieth edition）. JointFAO/WHOFood StandardsProgramme［M］.Rome：World Health Organization Food AgricultureOrganizationoftheUnited Nation，2011：66.

Determ ination of Aflatoxins in Citri Reticulatae Pericarpium by HPLC w ith Post-column Derivatization

Wei Ying1，Li Wendong2，Yang Lan1，Li Hongjun2，Chen Guanghua2，Liu Fu2
（1.College of Pharmacy，North Sichuan Medical University，Nanchong，Sichuan，China 637000；2.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of North
Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan，China 637000）

Objective To investigate the content of aflatoxin B1，B2，G1，G2in different batches Citri Reticulatae Pericarpium，in order to ensure the safety of clinical use.M ethods The content of aflatoxin B1，B2，G1，G2was determined by HPLC with post-column derivatization.The chromatography was performed on a Diamonsil C18column（150 mm×4.6 mm，5 um），with methanol-acetonitrile-water（40∶18∶42）as the mobile phase，the flow rate was 0.8 mL/min；fluorescence detection，the excitation wavelength was 360 nm，the emission wavelength was 450 nm.The 0.05%iodine solution was used as the derivatization reagent，which was delivered at a flow rate of 0.3 mL/min and the reaction coil was maintained at 70℃.Results There were no aflatoxin was determined in the Citri Reticulatae Pericarpium.The linear range of aflatoxin G2，G1，B1and B2were 108-1085 ng，217-2171 ng，191-1913 ng，64-644 ng，respectively.The recover rate was 60%-110%.Conclusion Aflatoxin was not detected in Citri Reticulatae Pericarpium which was safety and can be used for clinical prescription.The method is accurate and reliable，which can be used to control the content of aflatoxin in Citri Reticulatae Pericarpium.

aflatoxins；Citri Reticulatae Pericarpium；post-column derivatization with iodine；immunoaffinity columns；HPLC

R286.0；R282.71

A

1006-4931（2015）24-0160-03

魏瑩（1987-），女，碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與研究，（電子信箱）414697669@qq.com。

2015-08-13）