洋蔥伯克霍爾德氏菌Lu10-1產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張瑤路國(guó)兵周波王冰牟志美

（1.　山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，泰安　271018；2.　山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安　271018）

洋蔥伯克霍爾德氏菌Lu10-1產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張瑤1，2路國(guó)兵1周波2王冰2牟志美1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安271018）

旨在對(duì)洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）Lu10-1產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)探討了碳源、氮源、誘導(dǎo)物、初始pH值、溫度等主要發(fā)酵參數(shù)的影響，并初步考察了溫度、pH、金屬離子和有機(jī)溶劑等對(duì)其催化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵參數(shù)為：可溶性淀粉1.5%，蛋白胨1.5%，橄欖油3 g/L，K2HPO42 g/L，發(fā)酵溫度32℃，初始pH 9.0，培養(yǎng)48 h酶活達(dá)12.4 U/mL，比初始酶活提高了2.7倍。酶的最適溫度和pH值分別為60℃和9，在60℃以下保持100 h酶活仍保持在80%以上，在pH5.0-10.0之間活性穩(wěn)定，對(duì)甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑耐受性好。

脂肪酶；洋蔥伯克霍爾德氏菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），又稱三酰基甘油水解酶，不僅催化酯水解反應(yīng)還能催化酯合成反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，為重要的工業(yè)酶之一，廣泛應(yīng)用于生物能源、油脂工業(yè)、食品加工、皮革絹紡原料脫脂、洗滌工業(yè)、醫(yī)藥及飼料工業(yè)等諸多領(lǐng)域［1-3］。洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶在酶法催化生產(chǎn)生物柴油中極具應(yīng)用前途［4，5］。然而，目前脂肪酶的生產(chǎn)成本問(wèn)題成為酶法制備生物柴油的最大制約因素，優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化已成為提高脂肪酶產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵途徑。本實(shí)驗(yàn)室在前期分離鑒定了產(chǎn)脂肪酶的洋蔥伯克霍爾德氏菌Lu10-1［6］。本研究擬采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)Lu10-1的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并考察該酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在為進(jìn)一步提高脂肪酶的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和拓寬其工業(yè)應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 洋蔥伯克霍爾德氏菌B. cepacia Lu10-1由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，牛肉浸提物 5，NaCl 5，pH值7.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，蔗糖5，K2HPO42，橄欖油10，MgSO40.5，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：將活化菌種接種到10 mL種子培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。發(fā)酵培養(yǎng)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案改變培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，按5%接種量將上述種子液接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 單因素優(yōu)化 改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分如下：（1）碳源：可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘油（濃度設(shè)0.5%、1.0%、1.5%三水平）；（2）氮源：蛋白胨、酵母粉、（NH4）2SO4、NaNO3、尿素（濃度設(shè)1.0%、1.5%、2%三水平）；（3）橄欖油添加量為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L四水平；（4）K2HPO4：1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L；（5）金屬離子：CaCl2、MgCl2、CuCl2、MnCl2、ZnCl2（濃度設(shè)1 mmol/L、2.5 mmol/L兩水平）。

改變發(fā)酵條件如下：（1）培養(yǎng)溫度設(shè)25℃、28℃、30℃、32℃、37℃五個(gè)水平；（2）pH設(shè)7.5、8.0、8.5、9.0、9.5五個(gè)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組只改變一個(gè)因素，其他條件一致。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在以上單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵條件，采用“四因素三水平”方案，選取4個(gè)對(duì)產(chǎn)酶影響顯著的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 菌體生物量測(cè)定 采用分光光度計(jì)檢測(cè)菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，即OD600，以此測(cè)定菌體的生物量。

1.2.4.2 脂肪酶酶活測(cè)定 脂肪酶的酶活力測(cè)定采用以橄欖油為反應(yīng)底物的堿式滴定法［7］。酶活單位（U）定義為：在pH 7.0、50℃條件下，1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 μmoL的的游離脂肪酸所需的酶量。

1.2.4.3 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 以橄欖油為底物，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH8.0），在不同溫度（35-80℃）測(cè)定脂肪酶活力，以酶活最高為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活。將脂肪酶粗酶液放置于50-80℃）的水浴保溫，每隔一定時(shí)間將部分酶液取出，立即冰浴冷卻，測(cè)定殘留酶活。

1.2.4.4 最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性測(cè)定 以50 mmol/L的Na2HPO4/檸檬酸（pH4.0-6.0）、K2HPO4/ KH2PO（4pH6.5-8.5）和NaHCO3/Na2CO（3pH9.0-11.0）緩沖液為酶活測(cè)定緩沖液，在37℃測(cè)定脂肪酶酶活，考察酶的最適作用pH。將酶在不同pH值（pH5.0-11.0）的緩沖液中，于37℃下放置24 h后測(cè)殘余脂肪酶酶活，以初始未保溫（4℃，pH8.0）的酶活為100%，殘余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.4.5 有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶酶活的影響 5 mL脂肪酶酶液中加入終濃度75%（V/V）不同有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、正己烷、苯），20℃放置18 h后測(cè)定酶活。以未加有機(jī)溶劑的酶活設(shè)為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.4.6 表面活性劑對(duì)脂肪酶酶活的影響 5 mL脂肪酶酶液中加入不同濃度表面活性劑（Triton X-100、Tween 20、Tween 80、SDS和 TDOC），37℃ 保 溫5 min后測(cè)酶活。以未加表面活性劑的酶活設(shè)為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活。

2 結(jié)果

2.1 B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 種子生長(zhǎng)曲線和最佳種齡的確定 菌體生長(zhǎng)分為延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和消亡期4個(gè)時(shí)期。由圖1可知，0-6 h為菌體生長(zhǎng)延遲期，菌株在6 h以后開(kāi)始進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，并在10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后菌體生長(zhǎng)速度逐漸放慢，在有限的空間內(nèi)，菌體生長(zhǎng)達(dá)到飽和。選擇對(duì)數(shù)中后期的菌種最為合適，即可以確定生長(zhǎng)8-10 h的種子為最佳種齡。

2.1.2 碳源對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 培養(yǎng)基中碳源是最重要的組成部分。分別以0.5%、1.0%，1.5%三個(gè)水平的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘油為碳源，其他條件一致，測(cè)定酶活力，將最大脂肪酶活力設(shè)為100%，在30℃，200 r/min搖瓶發(fā)酵48 h以確定碳源對(duì)B. cepacia Lu10-1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2?？扇苄缘矸蹖?duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶促進(jìn)作用最大，且最適濃度為1%；而乳糖和甘油作碳源時(shí)產(chǎn)酶酶活相對(duì)較小，不適合作培養(yǎng)基中的碳源。因而，選擇1%可溶性淀粉為碳源最適于脂肪酶產(chǎn)量的提高。

圖1 B. cepacia Lu10-1種子生長(zhǎng)曲線

圖2 碳源對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.3 氮源對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 培養(yǎng)基中除了碳源外，氮源也很關(guān)鍵。分別以1.0%、1.5%、2.0%三個(gè)水平的蛋白胨、酵母粉、（NH4）2SO4、NaNO3、尿素為氮源，其他條件一致，測(cè)定酶活力。由圖3可知，蛋白胨對(duì)于B. cepacia Lu10-1產(chǎn)酶作用效果最好，且最適濃度為1.5%；其次是酵母粉，而（NH4）2SO4、NaNO3作氮源時(shí)產(chǎn)酶酶活只有50%-60%，不適合作發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖3 氮源對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.4 橄欖油添加量對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 橄欖油是脂肪酶作用的底物，也常作為脂肪酶表達(dá)的誘導(dǎo)物，其使用量對(duì)脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)效果影響很大。發(fā)酵培養(yǎng)基中橄欖油的添加量對(duì)B. cepacia Lu10-1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，初始脂肪酶活性隨橄欖油添加量增大而提高，橄欖油添加量在3 g/L時(shí)產(chǎn)酶活力最大，隨后橄欖油添加量增多反而使脂肪酶活力降低。

圖4 橄欖油添加量對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.5 K2HPO4對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 菌株B. cepacia Lu10-1在不同濃度K2HPO4的培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶情況差異不大（圖5）。在2 g/L K2HPO4的培養(yǎng)基中，菌株產(chǎn)酶能力達(dá)到最大值。

2.1.6 金屬離子對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 為確定金屬離子對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)酶是否有影響，分別將1.0 mmol/L和2.5 mmol/L的CaCl2、MgCl2、CuCl2、MnCl2、ZnCl2添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)36 h后測(cè)酶活結(jié)果見(jiàn)圖6。將最大脂肪酶活力設(shè)為100%，由圖6可知不同金屬離子對(duì)菌體產(chǎn)脂肪酶的作用不盡相同，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+對(duì)脂肪酶均沒(méi)有促進(jìn)作用，其中1 mmol/L的CaCl2的抑制作用最大。

圖5 K2HPO4對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

圖6 金屬離子對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.7 溫度對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 溫度是菌體生長(zhǎng)和蛋白合成分泌的重要影響因素。分別在25℃、28℃、30℃、32℃、35℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h測(cè)定菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，溫度過(guò)低，使菌體生長(zhǎng)緩慢；隨溫度升高，菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶速度加快；在32℃下酶活力達(dá)到最大值，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶活降低。因此，32℃為菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最適溫度。

圖7 溫度對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.8 初始pH值對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響 pH值也影響微生物代謝和產(chǎn)物合成的另一重要因素。圖8結(jié)果顯示，控制初始pH在8.0-9.0有利于菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，初始pH在8.0時(shí)菌體生長(zhǎng)最快，在pH9.0時(shí)酶活最高，綜合考慮最適產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為9.0。

圖8 初始pH值對(duì)B. cepacia Lu10-1產(chǎn)脂肪酶酶活的影響

2.1.9 正交試驗(yàn) 在上述單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵條件，采用“四因素三水平”方案，選取可溶性淀粉、蛋白胨、橄欖油乳化液、pH對(duì)產(chǎn)酶影響顯著的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表2所示。極差值的大小表明該因素水平的改變對(duì)結(jié)果的影響大小，極差值越大，該因素對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響就越大。由表2極差值大小，各因素對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響從大到小依次為：蛋白胨、橄欖油乳化液、可溶性淀粉、pH。為了獲得最高產(chǎn)量，應(yīng)選擇的最優(yōu)組合是A3B2C2D3，即可溶性淀粉1.5%，蛋白胨1.5%、橄欖油乳化液3 g/L、pH9。采用此最優(yōu)組合培養(yǎng)菌體最終酶活達(dá)12.4 U/mL，比初始酶活提高2.7倍。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9（34）

2.2 B. cepacia Lu10-1脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性 由于脂肪酶在生物化工、紡織等工業(yè)上應(yīng)用大多需要在高溫條件下進(jìn)行，因此對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性的考察十分必要。B. cepacia Lu10-1脂肪酶在35-80℃范圍內(nèi)的酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9-A。隨著溫度的升高，酶活力也逐漸升高，在溫度達(dá)到60℃時(shí)酶活最高；而當(dāng)溫度繼續(xù)上升后，酶活力逐漸下降，可能是由于高溫造成了酶蛋白逐漸變性。由圖9-A可知，酶作用的最適溫度為60℃，在此溫度下酶活力達(dá)到最高，以該值作100%脂肪酶活力，50℃、70℃時(shí)脂肪酶相對(duì)活力都能達(dá)到80%，80℃時(shí)酶幾乎失活，只有10%的相對(duì)酶活。將B. cepacia Lu10-1脂肪酶分別于50℃、60℃、70℃和80℃下保溫，考察其熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖9-B，該酶在60℃以下比較穩(wěn)定，保溫100 h后仍有80%以上的活性；在70℃下保溫30 h，酶活殘留60%左右，保溫100 h，酶活仍可達(dá)50%以上；80℃下保溫8 h后，酶活力基本喪失。

2.2.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 將脂肪酶活力測(cè)定緩沖液體系分別調(diào)至不同的pH，以最高酶活點(diǎn)為相對(duì)酶活100%，相對(duì)酶活與pH的關(guān)系如圖10-A所示。結(jié)果表明B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適pH為9.0。為考察B. cepacia Lu10-1脂肪酶的pH穩(wěn)定性，將其置于pH 5.0-11.0的緩沖體系中37℃保溫24 h后，測(cè)定殘留酶活。由圖10-B可知，脂肪酶在pH6.0-9.0范圍內(nèi)均具有很好的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活力均保持在95%以上；在pH5.0-11.0范圍內(nèi)保溫24 h，酶活仍可保持在70%以上；而當(dāng)pH大于10時(shí)，脂肪酶穩(wěn)定性急劇下降。

2.2.3 表面活性劑對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶酶活的影響 表面活性劑對(duì)脂肪酶的影響成為應(yīng)用的關(guān)鍵。洗滌劑中主要使用的是非離子表面活性劑和陰離子表面活性劑，本研究考察常用的非離子表面活性劑Triton X-100、Tween 20、Tween 80和陰離子表面活性劑SDS、TDOC對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶活性的影響。結(jié)果（圖11）表明，在1 mmol/L或10 mmol/L濃度下，Triton X-100、Tween 20、Tween 80和SDS對(duì)脂肪酶活性均有抑制作用，其中Tween 20的抑制作用最明顯；TDOC對(duì)脂肪酶有一定程度的激活作用，其中10 mmol/L的TDOC使脂肪酶活力提高28.7%。

圖9 B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）

圖10 B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）

圖11 表面活性劑對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶酶活的影響

2.2.4 有機(jī)溶劑對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶酶活的影響 生物柴油的生產(chǎn)在有機(jī)相中進(jìn)行，這就要求參與生產(chǎn)的脂肪酶具有良好的有機(jī)溶劑耐受性。將B. cepacia Lu10-1脂肪酶在終濃度75%的常用有機(jī)溶劑中于20℃保溫18 h，考察其在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性。由圖12可知，Lu10-1脂肪酶在甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、苯中均具有較好的穩(wěn)定性，而在異丙醇、丁醇中穩(wěn)定性較差。Lu10-1脂肪酶在有機(jī)溶劑尤其是甲醇、乙醇中良好的穩(wěn)定性，使其在生物柴油制造方面顯示出巨大的潛力。

3 討論

目前，脂肪酶的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用仍然受制于酶活低和生產(chǎn)成本高的限制。通過(guò)改良發(fā)酵參數(shù)，創(chuàng)造適合菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最佳條件以提高酶產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本在工業(yè)上有重要意義。影響微生物脂肪酶發(fā)酵的因素主要有：碳源、氮源、誘導(dǎo)劑、金屬離子、發(fā)酵溫度、pH等。在碳源方面，淀粉等碳水化合物對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶發(fā)酵有很好的促進(jìn)作用；在氮源方面，有機(jī)氮源相對(duì)于無(wú)機(jī)氮源能更好地促進(jìn)B. cepacia Lu10-1發(fā)酵產(chǎn)酶；在誘導(dǎo)劑方面，最適濃度的橄欖油可大大提高B. cepacia Lu10-1脂肪酶的產(chǎn)量；在金屬離子方面，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶均沒(méi)有促進(jìn)作用，這與Rashid等［8］研究發(fā)現(xiàn)Ca2+能顯著提高Pseudomonas sp. KB700A低溫脂肪酶產(chǎn)量的結(jié)果不一致。采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選獲得適宜發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)組合，使B. cepacia Lu10-1脂肪酶產(chǎn)量顯著提高。

圖12 有機(jī)溶劑對(duì)B. cepacia Lu10-1脂肪酶酶活的影響

脂肪酶作為重要的工業(yè)用酶之一，其酶學(xué)性質(zhì)也備受關(guān)注。不同來(lái)源脂肪酶，其適宜溫度、作用pH及酶的抑制劑和激活劑等都有較大差異。因此考察B. cepacia Lu10-1脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)具有較高的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。一般微生物脂肪酶最適溫度在30-40℃之間［9，10］。本研究報(bào)道的B. cepacia Lu10-1脂肪酶具有較高的作用溫度為60℃，而且穩(wěn)定性很好，60℃以下保溫100 h仍保持80%以上的酶活。大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶作用pH在中性或堿性范圍內(nèi)［10］。本研究報(bào)道B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適pH為9.0，有較寬的pH穩(wěn)定性，在pH5.0-10.0之間內(nèi)保溫24 h酶活均超過(guò)70%。此外，該酶還表現(xiàn)為較好的耐醇性，在甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、苯中保溫18 h仍能保持75%以上的活性。由此可見(jiàn)，B. cepacia Lu10-1脂肪酶具有熱穩(wěn)定性好、pH穩(wěn)定范圍寬以及良好的有機(jī)溶劑耐受性，已經(jīng)具備了作為工業(yè)用酶的條件，應(yīng)用前景廣闊。

4 結(jié)論

B. cepacia Lu10-1適宜發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵參數(shù)為：可溶性淀粉1.5%，蛋白胨1.5%，橄欖油3 g/L，K2HPO42 g/L，發(fā)酵溫度32℃，初始pH 9.0，培養(yǎng)48 h酶活達(dá)12.4 U/mL，比初始酶活提高了2.7倍。B. cepacia Lu10-1脂肪酶的最適溫度和pH值分別為60℃和9，60℃以下保溫100 h仍保持80%以上的酶活，在pH5.0-10.0之間內(nèi)保溫24 h酶活均超過(guò)70%，在甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、苯中保溫18 h酶活保持75%以上。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optim ization of Fermentation and Enzymatic Characterization of Lipase-producing Burkholder cepacia Lu10-1

Zhang Yao1，2Lu Guobing1Zhou Bo2Wang Bing1Mu Zhimei1
（1. College of Forestry，Shandong Agricultural University，Taian271018；2. College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian271018）

It is aimed to optimize the fermentation conditions of lipase-producing Burkholder cepacia Lu10-1 and analyze its enzymatic properties. The single factor and orthogonal experiments were adopted to study the major factors that affected the lipase yield， such as carbon，nitrogen， inducer， initial pH， temperature， etc. The impact of temperature， pH， metal ion， and organic solvents on lipase catalytic reaction was also primarily investigated. The optimal medium and culture conditions were as follows： soluble starch 1.5%， peptone 1.5%， olive oil 3 g/L， K2HPO42 g/L， temperature 32℃， initial pH 9.0， and fermentation time 48 h， the enzyme activity reached 12.4 U/mL， increased 2.7-fold compared to the initial activity. The optimal temperature and pH were 60℃ and 9.0 respectively. The lipase was stable under 60℃ for 100 h remaining over 80% of the activity and it was also stable at pH 5.0-10.0. Moreover， the lipase had solid tolerance to organic solvent such as methanol and ethanol.

lipase；Burkhoideria cepacia；fermentation；enzymatic characterization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.027

2014-12-20

中國(guó)博士后科學(xué)研究基金（2013M531641），山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后基金（76363），山東農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金（23786）

張瑤，女，博士，講師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：yaozhang@sdau.edu.cn

牟志美，女，教授，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：lz20011022@126.com