豚鼠和BALB/c小鼠對SEC2超抗原作用敏感性的比較

孟北乾張惠文張國俊徐明愷李旭張成剛

（1.中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100049；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽　110016）

豚鼠和BALB/c小鼠對SEC2超抗原作用敏感性的比較

孟北乾1.2張惠文2張國俊1.2徐明愷2李旭2張成剛2

（1.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽110016）

比較分析豚鼠和BALB/c小鼠對金黃色葡萄球菌腸毒素C2（Staphylococcus enterotoxin C2，SEC2）超抗原作用的敏感性差異，確定更適合用于SEC2超抗原作用研究的模式動物。體外試驗，以梯度濃度SEC2刺激豚鼠和BALB/c小鼠的外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和脾淋巴細(xì)胞，MTS染色法檢測其增殖；體內(nèi)實驗，SEC2腹腔注射豚鼠和BALB/c小鼠，每隔3 d檢測豚鼠和小鼠的體重、體溫變化情況；每隔7 d采血，ELISA法檢測血清中IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌水平。不同濃度的SEC2均能刺激小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞顯著增殖（P＜0.05），而對豚鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞無效。腹腔注射后，SEC2組和對照組豚鼠和小鼠的體溫均無顯著性變化（P＞0.05）；豚鼠SEC2組體重在給藥后期顯著低于對照組（P＜0.05），小鼠的SEC2組體重在給藥后第3-30天均顯著低于對照組（P＜0.05），此后恢復(fù)到正常水平（P＞0.05）；給藥后各時間點，小鼠的SEC2組血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌水平均顯著高于對照組（P＜0.05），而豚鼠的SEC2組血清中細(xì)胞因子分泌水平與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。與豚鼠相比，BALB/c小鼠對SEC2超抗原活性的敏感程度更高，且表現(xiàn)出很好的劑量和時間效應(yīng)，適合作為模式動物用于SEC2的超抗原活性研究。

豚鼠；小鼠；金黃色葡萄球菌腸毒素C2

金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是致熱性毒素超抗原（Pyrogenic toxin superantigen，PTSAgs）中的一種，有著相似的結(jié)構(gòu)、功能和基因序列。作為超抗原（Superantigen，SAgs）家族中最主要的成員，SEs能夠在極低劑量下不經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC）處理，直接與MHC-Ⅱ類分子和T細(xì)胞Vβ區(qū)結(jié)合成三聚體結(jié)構(gòu)，刺激T淋巴細(xì)胞增殖，其激活T淋巴細(xì)胞數(shù)量是普通抗原的數(shù)千至數(shù)萬倍［1］。因為SEs所具有的超抗原活性，可作為免疫增強劑，在腫瘤的免疫治療和疫苗佐劑方面具有應(yīng)用前景［2］。

金黃色葡萄球菌腸毒素C2（Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2）作為SEs的典型代表，與其他型腸毒素一樣都是潛在的胃腸毒素，可引起食物中毒，伴隨著腹瀉、嘔吐和發(fā)熱等病癥。但與SEA和SEB相比，SEC2毒性較為溫和，更適合醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用，因此近年來SEC2廣受研究者的關(guān)注。有大量關(guān)于其超抗原免疫活性特點的研究報道，而選取合適的實驗動物作為研究模型則尤為重要［3，4］。

豚鼠和BALB/c小鼠都是免疫學(xué)研究中最常用的實驗動物。豚鼠常常被用于過敏和傳染病學(xué)等研究領(lǐng)域，李華等［5］以豚鼠作為支氣管哮喘的動物模型，探究SEB對其氣道炎癥及Th1/Th2細(xì)胞因子的影響。而BALB/c小鼠常常被用于免疫反應(yīng)和腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域，我們前期研究曾以BALB/c小鼠作為抗腫瘤實驗動物模型，探究SEC2及其衍生物改構(gòu)體的抗腫瘤作用［6］。在感染與免疫研究中，尤其是疫苗及疫苗佐劑的研究領(lǐng)域，豚鼠是更適宜的實驗動物模型。而在腫瘤治療研究領(lǐng)域中，BALB/c小鼠則更適宜作為實驗動物模型。目前對于金黃色葡萄球菌腸毒素的超抗原活性研究還沒有有關(guān)確定合適的模式實驗動物的報道，因此我們以SEC2為例，對比分析豚鼠和BALB/c小鼠對其超抗原活性的反應(yīng)敏感程度，確立合適的模式動物，旨為進(jìn)一步的理論研究和醫(yī)藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 350-400 g SPF級實驗用雌性豚鼠和6-8周齡BALB/C雌性小鼠均購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于20-24℃，濕度約30%室內(nèi)清潔鼠籠具內(nèi)，自由攝食，提供無菌全價營養(yǎng)顆粒飼料（豚鼠飼料含維生素C），飲用水符合中華人民共和國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；豚鼠和小鼠給藥前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，此期間內(nèi)無精神不正?，F(xiàn)象、無攝食不正?，F(xiàn)象、無其他疾病發(fā)生。

1.1.2 試劑 豚鼠和小鼠細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的ELISA檢測試劑盒購自美國TSZ公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；MTS購自Promega公司；ProteinShow-G250蛋白快速染色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；豚鼠和小鼠的淋巴細(xì)胞分離液購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；可表達(dá)重組SEC2蛋白的大腸桿菌基因工程菌由本實驗室保存［7］。

1.2 方法

1.2.1 SEC2表達(dá)與純化 SEC2蛋白的表達(dá)與純化參照我們前期研究［7］中所述方法進(jìn)行，獲得純化蛋白后，以15%SDS-PAGE分析純度。純化的SEC2按照Super-Bradford法測定蛋白濃度，過濾除菌后-70℃保存。

1.2.2 體外淋巴細(xì)胞刺激增殖實驗 豚鼠以心臟采血法收集血液15 mL，1∶1體積比加入稀釋液（RPMI 1640培養(yǎng)基），混勻抗凝血，取15 mL離心管，加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液（取用前恢復(fù)至室溫并搖勻）于每支離心管，將稀釋過的血液覆蓋在分離液上層（保持液面分界明顯），25℃下1 500 r/min離心30 min；取中間白膜層即為淋巴細(xì)胞層，再加入2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基于每支離心管，顛倒洗滌。25℃下1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞；每支離心管內(nèi)加紅細(xì)胞裂解液（8.9 g NH4Cl，1 g KHCO3，37.2 mg Na2EDTA，pH7.2-7.4，定容至1 L，過濾除菌）1 mL，同上離心，收集細(xì)胞。小鼠以內(nèi)眥采血法收集血液，同上方法收集小鼠的PBMC。

無菌條件下摘取豚鼠和小鼠脾臟，剪碎研磨過200目細(xì)胞篩，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，再以無血清RPMI 1640清洗獲得豚鼠和小鼠的脾淋巴細(xì)胞。

以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整豚鼠和小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞濃度，以5×106cells/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再加入SEC2使終濃度為1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基作陰性對照。另設(shè)SEC2與終濃度為2.5 μg/mL的植物凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）協(xié)同刺激豚鼠的脾淋巴細(xì)胞。在CO2濃度為5%、37℃下培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡下觀察豚鼠和小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖情況。MTS染色法檢測豚鼠和小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖，檢測波長490 nm，參比波長690 nm。

以增殖指數(shù)（Proliferation index，PI）表示刺激豚鼠和小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖能力，PI=實驗組吸光值/陰性對照組吸光值。

1.2.3 SEC2對豚鼠和小鼠體內(nèi)給藥方法 豚鼠和BALB/c小鼠分別分成給藥組和生理鹽水對照組，豚鼠每組5只，小鼠每組8只。SEC2給藥劑量為單位體重劑量（2.5 mg/Kg），陰性對照組注射等體積生理鹽水，豚鼠和小鼠各組均腹腔給藥一次，分別在給藥的第0天、第7天、第14天，第21天，第28天和第35天進(jìn)行采血，豚鼠和小鼠分別以心臟采血法和內(nèi)眥采血法進(jìn)行采血。血液樣品于4℃中靜置30 min，在4℃下5 000 r/min 離心10 min分離血清，血清保存于-70℃用于ELISA檢測。

1.2.4 檢測豚鼠和小鼠的體重、體溫 給藥后第1天開始，（以數(shù)字型動物體溫計）檢測豚鼠和小鼠的直腸溫度，并稱量動物體重，每隔3 d檢測一次，直到采血結(jié)束。豚鼠和小鼠的體溫、體重用于反映在實驗過程中豚鼠和小鼠的一般生理健康狀況。

1.2.5 ELISA檢測血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α 豚鼠和小鼠的血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α采用ELISA法檢測。按試劑盒說明書操作，簡述過程為：在96孔板上分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不接觸孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃孵育30 min后，棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋好的洗滌液，靜置30秒后棄去洗滌液，如此重復(fù)5次，拍干。加入標(biāo)記抗體，再次孵育，后再次洗滌。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min后，每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，以空白調(diào)零，450 nm測OD值（測定應(yīng)在終止液加入后的15 min以內(nèi)）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算待測品濃度。

1.2.6 統(tǒng)計分析 結(jié)果采用x-±s表示，每個樣品至少3次重復(fù)實驗，每個實驗至少3次獨立重復(fù)實驗。采用t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。P ＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素C2的表達(dá)與純化

由本實驗室構(gòu)建的可表達(dá)重組SEC2的大腸桿菌工程菌經(jīng)過培養(yǎng)，誘導(dǎo)，超聲破壁，再經(jīng)過親和層析獲得SEC2蛋白純品，經(jīng)15%SDS-PAGE電泳檢測（圖1），純度達(dá)到95%以上。

圖1 SEC2 SDS-PAGE電泳圖

2.2 SEC2刺激豚鼠和小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖實驗

體外實驗中，SEC2可劑量依賴性的刺激BALB/c小鼠PBMC（圖2）和BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖效應(yīng)（圖3），誘導(dǎo)顯著增殖的最低SEC2濃度為10 ng/mL（P＜0.05）。在最高劑量SEC2刺激下（10 000 ng/mL），小鼠PBMC的PI值接近3（圖2），小鼠脾淋巴細(xì)胞的PI值為2.7（圖3）。倒置顯微鏡對增殖細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn)，SEC2刺激下的BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞形成了明顯的增殖細(xì)胞簇，細(xì)胞簇周圍的淋巴細(xì)胞分布緊密，并且增殖細(xì)胞簇的數(shù)量和大小隨著SEC2濃度增加而呈現(xiàn)遞增趨勢（圖4A-E）。

圖2 小鼠和豚鼠的PBMC增殖指數(shù)

圖3 小鼠和豚鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)

對豚鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞刺激實驗發(fā)現(xiàn)，僅最高濃度的SEC2（10，000 ng/mL）刺激豚鼠的PBMC產(chǎn)生增殖效應(yīng)（P＜0.05），但PI值僅為1.2左右（圖2）。此外，1-10 000 ng/mL的SEC2均未能激活豚鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生任何顯著增殖效應(yīng)（P＞0.05），甚至出現(xiàn)增殖指數(shù)＜1的狀況（圖3）。這說明在SEC2作用下，豚鼠脾淋巴細(xì)胞的死亡速度已經(jīng)超過增殖速度。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在梯度濃度的SEC2刺激下，豚鼠的脾淋巴細(xì)胞并沒有形成明顯的增殖細(xì)胞簇，且細(xì)胞分布稀疏。僅陽性對照PHA刺激豚鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖細(xì)胞簇（圖4-F-J）。

圖4 梯度濃度SEC2與PHA協(xié)同刺激豚鼠和小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖圖

為了進(jìn)一步加強對豚鼠的脾淋巴細(xì)胞刺激，采用終濃度為2.5 μg/mL的PHA和梯度濃度SEC2聯(lián)合刺激豚鼠的脾淋巴細(xì)胞（圖4-3K-M），100-10 000 ng/mL的SEC2均未能和PHA產(chǎn)生協(xié)同刺激作用，各劑量組的增殖細(xì)胞簇的數(shù)量與大小仍然與單獨PHA刺激組相當(dāng)，該結(jié)果表明，在體外實驗中，豚鼠免疫細(xì)胞對于SEC2的超抗原活性可能并不敏感，而小鼠對于SEC2的超抗原活性反應(yīng)強烈，具有極好的敏感性，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

圖5 豚鼠（A）和小鼠（B）的SEC2給藥組和生理鹽水組體溫

2.3 豚鼠和小鼠的體溫及體重

SEC2腹腔給藥后豚鼠和BALB/c小鼠的體溫情況如圖5所示，豚鼠和小鼠的SEC2給藥組和生理鹽水組體溫均沒有顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明SEC2對豚鼠和小鼠并沒有產(chǎn)生顯著的致熱活性。豚鼠和小鼠的體重如圖6所示，豚鼠的SEC2給藥組和生理鹽水組體重均沒有顯著性差異（P＞0.05），但是在檢測第15 d后，兩組體重變化趨勢逐現(xiàn)差異，SEC2給藥組體重增長速度明顯慢于對照組，并且最終對照組體重高于SEC2給藥組大約14.78%，而小鼠的SEC2給藥組和生理鹽水組體重增重相對平穩(wěn)，但是從免疫第1天到免疫第30天，給藥組的小鼠增重顯著低于生理鹽水組小鼠，并在第33后恢復(fù)至正常水平。結(jié)果表明SEC2對豚鼠和小鼠的攝食均產(chǎn)生了顯著性的負(fù)面影響。

圖6 豚鼠（A）和小鼠（B）的SEC2給藥組和生理鹽水組體重

2.4 ELISA檢測細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α

本實驗通過ELISA法檢測豚鼠和小鼠給藥后血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌水平。實驗結(jié)果（圖7）表明，豚鼠的SEC2給藥組血清中四種細(xì)胞因子與豚鼠生理鹽水對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。而在BALB/c小鼠實驗中，SEC2在給藥初期即能夠強烈誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IL-4，在免疫后第7天，IL-4的分泌水平開始呈現(xiàn)上升趨勢，第14天達(dá)到最高，之后持續(xù)到第28天開始出現(xiàn)下降趨勢，至第35天仍顯著高于生理鹽水對照組（P＜0.05），表明SEC2能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫應(yīng)答，而對豚鼠無顯著性作用。SEC2給藥后第21天開始誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IFN-γ，且隨著時間推移逐步升高，直至第35天仍處于上升趨勢，而SEC2卻不能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生IFN-γ。SEC2給藥后第7天即可強烈誘生小鼠血清中IL-2水平（P＜0.05），到給藥后第28天達(dá)到峰值，直至第35天仍處于較高水平。SEC2同樣誘導(dǎo)小鼠分泌TNF-α，其分泌水平從給藥后第7天開始逐步升高，第14天時顯著高于生理鹽水對照組，直至第35天仍處于上升趨勢。以上實驗結(jié)果初步說明SEC2在豚鼠體內(nèi)既沒有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫也沒有誘導(dǎo)體液免疫，暗示豚鼠可能并不是SEC2超抗原活性的敏感動物；而SEC2可以強烈刺激BALB/c小鼠免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)了小鼠血清中細(xì)胞因子的顯著性升高，進(jìn)一步表明BALB/c小鼠是SEC2超抗原活性的反應(yīng)敏感動物。

圖7 豚鼠和小鼠給藥后血清細(xì)胞因子分泌水平

3 討論

豚鼠和BALB/c小鼠都是免疫學(xué)研究中常用的模式動物，并且都有報道用于SEs的超抗原活性研究方面。例如，在豚鼠鼻腔多次施加金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）可以刺激豚鼠黏膜免疫系統(tǒng)引發(fā)過敏性鼻炎［8］；而在以BALB/c小鼠為模式動物的腫瘤免疫治療研究中，SEA、SEB和SEC2均可強烈激活小鼠免疫系統(tǒng)，對腫瘤實現(xiàn)免疫治療作用［9］。

SEs作為一種超抗原，其激活T淋巴細(xì)胞的主要途徑是與含特異性Vβ側(cè)鏈的T淋巴細(xì)胞受體（T Cell Receptor，TCR）識別結(jié)合，并且不同種類SEs識別Vβ種類也不同，這是決定超抗原活性的最重要因素［10］。另外，不同動物種屬之間其TCR的Vβ也有明顯差異。如人的TCR有24種Vβ亞型，而小鼠有22種Vβ亞型，并且人和小鼠之間TCR的Vβ氨基酸序列也存在明顯差異。以上這些因素導(dǎo)致SEs的超抗原活性具有一定種屬差異性［11］。SEC2是SEs家族中毒性溫和且活性較高的一種，極有潛力作為免疫激活劑用于醫(yī)藥領(lǐng)域，因此近年來對于其作用機理和應(yīng)用的研究增多，這就需要合適的模式動物用于研究，而關(guān)于對SEC2超抗原活性敏感的模式動物，目前尚無研究報道。因此本文研究目的就是對比分析豚鼠和BALB/c小鼠對SEC2超抗原作用的敏感性，尋找更適合用于SEC2超抗原活性研究的模式動物。

本研究的體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEC2并沒有像促進(jìn)小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖那樣促進(jìn)豚鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖，相反，甚至在較低濃度刺激下出現(xiàn)了大量細(xì)胞死亡，為了提升豚鼠脾淋巴細(xì)胞對SEC2的敏感性，我們設(shè)計以SEC2和PHA聯(lián)合刺激豚鼠的脾淋巴細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合刺激與PHA單獨刺激相比，并未增加豚鼠脾淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞簇的數(shù)量和大小，二者效果無明顯差異。由此結(jié)果推斷，可能是由于豚鼠對SEC2超抗原活性的刺激并不敏感導(dǎo)致。在進(jìn)一步的體內(nèi)實驗中，我們用ELISA法檢測SEC2腹腔注射后豚鼠和小鼠各組血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。IL-4和IFN-γ是誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。其中，IL-4在促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的同時，也能夠刺激肥大細(xì)胞的增殖，并且提升巨噬細(xì)胞遞呈抗原能力［12］。IFN-γ屬Ⅱ型干擾素，主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有增強細(xì)胞免疫功能，同時還可以刺激中性粒細(xì)胞，促進(jìn)其吞噬作用和增強巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)等作用［13］。IL-2主要由活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)Th0細(xì)胞增殖分化，并且增強細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic lymphocyte，CTL）活性［14，15］。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK）分泌產(chǎn)生，與相應(yīng)受體結(jié)合后引起靶細(xì)胞溶解，并且可增強中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增強抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）［16］。對以上這些細(xì)胞因子的檢測，可以較為系統(tǒng)的評價SEC2超抗原活性對動物免疫系統(tǒng)的激活能力。實驗結(jié)果表明，豚鼠的SEC2給藥組和生理鹽水組血清中，各細(xì)胞因子沒有顯著性差異，SEC2沒有誘導(dǎo)豚鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效的細(xì)胞因子；而在小鼠體內(nèi)，SEC2能顯著性地誘導(dǎo)小鼠大量分泌上述細(xì)胞因子。以上體內(nèi)和體外實驗結(jié)果可以初步證明，豚鼠的免疫系統(tǒng)對SEC2的超抗原作用不敏感；而BALB/c小鼠的免疫系統(tǒng)對SEC2的超抗原活性表現(xiàn)出很好的敏感性，更適合作為研究SEC2超抗原活性的模式動物。

李華和Tang等［5，8］的研究發(fā)現(xiàn)SEB可以激活豚鼠免疫，而本研究采用的SEC2，盡管在一級結(jié)構(gòu)上與SEB較為同源，但卻未能發(fā)現(xiàn)對豚鼠免疫系統(tǒng)的激活效應(yīng)。分析其可能的原因，SEC2和SEB盡管一級結(jié)構(gòu)相似，均與MHC-Ⅱ類分子的α鏈和TCR的Vβ區(qū)特異位點結(jié)合，但是在三級結(jié)構(gòu)上還存在一些差異。SEB和SEC2的晶體結(jié)構(gòu)表明，除了SEC2具有鋅離子結(jié)合位點外，在SEC2的51-61氨基酸位點（涉及β2和β3折疊區(qū)）、97-110氨基酸位點（涉及二硫環(huán)結(jié)構(gòu)和β5折疊的部分區(qū)域）、120-129氨基酸結(jié)構(gòu)位點（涉及β6折疊部分區(qū)域）、137-140氨基酸結(jié)構(gòu)位點（涉及β6和β7折疊區(qū)）、152-155氨基酸結(jié)構(gòu)位點（涉及β8折疊區(qū)）和193-194氨基酸結(jié)構(gòu)位點（涉及β10折疊區(qū)）均有不同［17］。這些重要位點的不同可能導(dǎo)致了SEB與SEC2蛋白分子三維結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，進(jìn)而在免疫識別過程中造成了很大不同。SEB與小鼠TCR的Vβ3、Vβ7和Vβ8具有更好的親和力，而SEC2與小鼠TCR的Vβ8.2、Vβ8.3結(jié)合更強［11］。由此判斷，SEB和SEC2在與TCR結(jié)合上的微弱差別可能是造成豚鼠與BALB/c小鼠對SEC2敏感性截然不同的主要因素，不過該假設(shè)需要進(jìn)一步實驗驗證。

4 結(jié)論

體外實驗結(jié)果表明，SEC2不能刺激豚鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖，而能夠劑量依賴性地刺激BALB/c小鼠的PBMC和脾淋巴細(xì)胞增殖。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，SEC2可強烈激活小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)，顯著提升小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的分泌水平，而對豚鼠體內(nèi)免疫無明顯刺激作用。研究結(jié)果初步說明，與豚鼠相比，BALB/c小鼠的免疫系統(tǒng)對SEC2的超抗原刺激作用更加敏感，更適合作為研究SEC2超抗原活性的模式動物。

［1］Fraser JD， Proft T. The bacterial superantigen and superantigen-like proteins［J］. Immunological Reviews， 2008（225）：226-243.

［2］ Wang XG， Xu MK， Zhang HW， et al. Enhancement of superantigen activity and antitumor response of staphylococcal enterotoxin C2 by site-directed mutagenesis［J］. Cancer Immunol Immunother， 2009（58）：677-686.

［3］ Liu YL， Xu MK， Zhang HW， et al. SEC2-induced superantigen and antitumor activity is regulated through calcineurin［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2013， 97（22）：9695-9703.

［4］ Liu YL， Xu MK， Li X， et al. The construction of a bifunctional fusion protein consisting of SEC2 and EGFP［J］. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2014， 61（5）：565-571.

［5］ 李華， 陸麗， 劉金保， 等. 金黃色葡萄球菌腸毒素B對豚鼠哮喘模型Th1/Th2細(xì)胞因子的影響［J］. 免疫學(xué)雜志， 2006， 22（3）：139-141.

［6］ 張國俊， 徐明愷， 孫健， 等. 增強型金黃色葡萄球菌腸毒素C2突變體及其超抗原活性［J］. 生物工程學(xué)報， 2013， 29（6）：803-813.

［7］ 張國俊， 鄒謹(jǐn)， 徐明愷， 等. 活性增強的SEC2截短突變蛋白的構(gòu)建及其生物活性研究［J］. 生物技術(shù)， 2012， 22（6）：31-35.

［8］ Tang XY， Sun R， Hong SL， et al. Repeated intranasal instillation with staphylococcal enterotoxin B induces nasal allergic inflammation in guinea pigs［J］. American Journal of Rhinology & Allergy， 2011，25（3）：176-181.

［9］ Xu MK， Wang XG， Cai YM， et al. An engineered superantigen SEC2 exhibits promising antitumor activity and low toxicity［J］. Cancer Immunology Immunotherapy， 2011， 60（5）：705-714.

［10］ Li ZJ， Omoe K， Shinagawa K， Yagi J， et al. Interaction between superantigen and T-cell receptor Vbeta element determines levels of superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity of CD8（+）T cells in induction and effector phases［J］. Microbiol Immunol，2009， 53（8）：451-459.

［11］ Llewelyn M， Sriskandan S， Terrazzini N， et al. The TCR Vb signature of bacterial superantigens spreads with stimulus strength［J］. International Immunology， 2006， 18（10）：1433-1441.

［12］ Ranasinghe C， Trivedi S， Danushka K， et al. IL-4 and IL-13 receptors：Roles in immunity and powerful vaccine adjuvants［J］. Cytokine & Growth Factor Reviews， 2014， 25（4）：437-442.

［13］ Ogawa， Hirom i， Mukai K， Kawano Y， et al. Th2-inducing cytokines IL-4 and IL-33 synergistically elicit the expression of transmembrane TNF-a on macrophages through the autocrine action of IL-6［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2012， 420（1）：114-118.

［14］ Sharma R， Fu SM， Ju ST. IL-2：A two-faced master regulator of autoimmunity［J］. Journal of Autoimmunity， 2011， 36（2）：91-97.

［15］ Liao W， Lin JX， Leonard， et al. IL-2 family cytokines：new insights into the complex roles of IL-2 as a broad regulator of T helper cell differentiation［J］. Current Opinion in Immunology， 2011， 23（5）：598-604.

［16］ Pullyblank AM， Guillou PJ， Monson JRT， et al. Interleukin-1 and tumor-necrosis-factor-alpha may be responsible for the lytic mechanism during antitumor antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity［J］. British Journal of Cancer， 1995， 72（3）：601-606.

［17］ Papageorgion AC， Acharya KR， Shapiro R， et al. Crystal-structure of the superantigen enterotoxin c2 from Staphylococcus aureus reveals a zinc-binding site［J］. Structure， 1995， 3（8）：769-779.

（責(zé)任編輯 李楠）

Com parison of the Superantigen Sensitivity on Staphylococcal Enterotoxins C2 in Guinea Pigs and BALB/c M ice

Meng Beiqian1，2Zhang Huiwen2Zhang Guojun1，2Xu Mingkai2Li Xu2Zhang Chenggong1
（1. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100049；2. Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang110016）

This work is to analyze and compare the superantigen sensitivity on staphylococcal enterotoxins C2（SEC2）in guinea pigs and BALB/c mice， and determine the model animal for the researches of superantigen sensitivity on SEC2. In vitro， peripheral blood mononuclear cell（PBMC）and splenocytes from guinea pigs and BALB/c mice were respectively stimulated with SEC2 at gradient concentration， and the cell proliferation was tested by MTS assay；In vivo， the changes of temperature and weight of guinea pigs and mice were measured at interval of 3 d after the intraperitoneal injection of SEC2. Meanwhile， the serums were collected at interval of 7 d to detect the levels of IL-4， IFN-γ， IL-2 and TNF-α by ELISA. SEC2 of different concentrations significantly stimulated the proliferation of PBMC and splenocytes from BALB/c mouse（P ＜0.05）， but not so from guinea pigs（P ＞ 0.05）. After intraperitoneal injection of SEC2， there was no significant difference in body temperature of both guinea pigs and mice（P ＞ 0.05）compared to the control. In the later phase of the experiment， the body weights of guinea pigs in SEC2 group were significantly lower than those in control group（P ＜ 0.05）. And the body weights of mice in SEC2 group were also significantly lower than those in control group during day 3 to 30， but recovered to normal level at the end of the experiment（P ＞ 0.05）. The cytokines IL-4， IFN-γ， IL-2 and TNF-α in serum of mice of SEC2 group were significantly elevated compared with in control group（P ＜ 0.05）. However，there was no significant difference in guinea pigs administrated with SEC2 and physiological saline（P ＞ 0.05）. In conclusion， comparing with guinea pigs， BALB/c mice are more sensitive to the stimulation of SEC2 with promising dose-dependent and time-dependent manner. Therefore，BALB/c mouse is a suitable model animal for the researches of superantigen activity.

guinea pig；mouse；staphylococcal enterotoxins C2

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.032

2015-01-11

十二五國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2012ZX09102301-013），沈陽市科技計劃項目（F11-264-1-11，F(xiàn)12-152-9-00）

孟北乾，男，碩士研究生，研究方向：口蹄疫疫苗佐劑的研究；E-mail：13995111458@163.com

徐明愷，男，博士，研究員，研究方向：生物大分子免疫活性研究與藥用開發(fā)；E-mail：mkxu@iae.ac.cn