高產(chǎn)鐵載體假單胞菌的篩選及其對鐵氧化物的利用

朱慧明張彥楊洪江

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院　工業(yè)微生物教育部重點實驗室　天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津　300457；2.天津雙聯(lián)科鑫生物科技有限公司，天津　300403）

高產(chǎn)鐵載體假單胞菌的篩選及其對鐵氧化物的利用

朱慧明1張彥2楊洪江1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點實驗室天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457；2.天津雙聯(lián)科鑫生物科技有限公司，天津300403）

篩選高產(chǎn)鐵載體的微生物，研究鐵載體的抑菌作用和對不溶性未定型鐵氧化物（poorly crystalline iron hydroxides，PCIH）的利用。CAS法篩選高產(chǎn)鐵載體菌株，采用瓊脂擴(kuò)散法和生長抑制測定鐵載體的抑菌作用，利用16S rRNA基因序列比對鑒定分離菌株，并根據(jù)分離菌株的生長情況，確定鐵載體對不溶性PCIH的利用。從土壤樣品中共篩選到172株產(chǎn)鐵載體的菌株，高產(chǎn)鐵載體菌株13株，其中僅有菌株Z158的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、普通變形桿菌和副溶血性弧菌具有抑菌作用，抑菌率分別為51.3%、50.2%、37.1%和28.0%。比對該菌株的16S rRNA基因序列，確定Z158屬于Pseudomonas aeruginosa。當(dāng)不溶性的PCIH作為唯一可利用的鐵源時，菌株Z158培養(yǎng)24 h的生物量比無鐵條件下提高了46.1%。銅綠假單胞菌Z158分泌的鐵載體能夠抑制病原菌的生長，同時還能獲取不溶性未定型鐵氧化物PCIH中的鐵元素。

鐵載體；銅綠假單胞菌；抑菌；未定型鐵氧化物

鐵元素不僅參與維持微生物細(xì)胞內(nèi)多相體系的滲透平衡，還是微生物代謝過程中多種酶反應(yīng)的必要成分，鐵元素的缺乏能夠限制微生物的生長。在中性和堿性條件下，鐵元素主要以不溶的礦物質(zhì)形式存在，難以滿足微生物的正常生長。在可溶性鐵極度缺乏的環(huán)境中，微生物通過合成和分泌鐵載體獲取鐵元素。鐵載體是一類特異性螯合Fe3+的金屬配體，與Fe3+結(jié)合的官能團(tuán)和中心結(jié)構(gòu)具有多樣性，主要包括氧肟酸型、兒茶酚型和多羥基羧酸型［1］。

鐵載體對Fe3+具有較高親和力，與Fe3+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在任何pH值下對不溶性鐵礦物質(zhì)的溶解度都有顯著地影響。有研究報道，假單胞菌Pseudomona s sp.和P. mendocin在鐵元素缺乏下，能夠從不溶性的赤鐵礦（Hematite）中獲取鐵元素維持自身的生長［2，3］。假單胞菌產(chǎn)生的鐵載體，不能被本屬以外的其它微生物利用，因此能夠抑制其它微生物的生長，減少植物根部病原菌的數(shù)量；同時，鐵載體鐵離子絡(luò)合物也可作為一種鐵源被植物利用，促進(jìn)植物的生長，這些特點使假單胞菌在植物的生物防護(hù)中能夠發(fā)揮重要作用［4］。

為了進(jìn)一步挖掘微生物資源，本研究從環(huán)境中分離了高產(chǎn)鐵載體菌株，分析了鐵載體對4種常見致病菌的抑制作用，同時還分析了鐵載體溶解不溶性未定型鐵氧化物（Poorly crystalline iron hydroxides，PCIH）的能力，旨在為生防菌的候選菌株，用于植物細(xì)菌性感染的防治和促進(jìn)植物的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基用于細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)；Modified Sucrose-Aspartate培養(yǎng)基（MSA）、Modified King B培養(yǎng)基（MKB）、Succinate medium（SM）［5］和Arginine medium（AM）［6］，主要用于細(xì)菌鐵載體的合成；Chrome Azurol S溶液（固體CAS則需額外添加10 g/L瓊脂）［7］，用于檢測鐵載體。

未定型鐵氧化物（Poor crystalline iron hydroxides，PCIH）的制備：0.02 mol/L Fe（NO3）3，快速加入1 mol/L NaOH至pH值為7.0，室溫下攪拌24 h，離心，水洗除去大量的Na+和NO3-后，真空冷凍干燥24 h。使用前加入到培養(yǎng)基中，115℃滅菌25 min［8］。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)鐵載體菌株的篩選 取薊運河土壤梯度稀釋，稀釋液涂布在MSA平板上，待菌落長出后覆蓋一層CAS藍(lán)色培養(yǎng)基，觀察菌落周圍顏色變化，15 min內(nèi)與CAS發(fā)生顏色變化的菌株被定義為PSSP（Potentially strong siderophore producers）；而顏色變化不完全或者顏色變化時間超過12 h的菌株被定義為BSP（Borderline siderophore producers）［9］，將菌落周圍顏色發(fā)生變化的菌株劃線純化。挑單菌落于液體MSA培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，10 000 r/min離心5 min，取等體積無細(xì)胞上清與CAS溶液混合，室溫下靜置1 h，測定OD680［10］。用鐵載體活性單位（Siderophore units，SU）表示鐵載體的產(chǎn)量，SU=［（Ar-As）/Ar］×100%，Ar是未接種的培養(yǎng)基與等體積CAS混合OD680，As是菌株上清與等體積CAS混合OD680；并對細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行劃分，As/Ar從1.0-0之間以0.2為間隔，每減小0.2增加一個“+”，一般產(chǎn)鐵載體能力較高的細(xì)菌其As/Ar低于0.5［11］。

1.2.2 瓊脂擴(kuò)散法測定PSSP菌株對常見致病菌的抑菌情況 采用瓊脂擴(kuò)散法［12］測定PSSP菌株的抑菌效果，具體步驟是對PSSP菌株單菌落打孔，連同培養(yǎng)基一起取出放置在事先涂布有金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、普通變形桿菌和副溶血性弧菌的MKB平板上，37℃培養(yǎng)12-24 h，測定抑菌圈大小。

1.2.3 菌株的分子鑒定鐵載體 按照文獻(xiàn)提供的方法提取菌株的基因組DNA［13］，并以此為模板利用通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA片段，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行序列測定，將得到的序列遞交于GenBank，通過Blast檢索，在GenBank中的已知序列中進(jìn)行同源性分析，確定與分離菌株同源程度最高的序列；同時利用Ribosomal Database ProjectⅡ軟件Classifer，對分離的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分類分析；利用MEGA5.0中Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株的進(jìn)化地位。

1.2.4 液體混合法測定鐵載體對常見致病菌的抑菌情況 在MSA培養(yǎng)基中加入FeCl3，使培養(yǎng)基中Fe3+的終濃度分別為0、0.5、1、5、10、100、200μmol/L，30℃、200 r/min培養(yǎng)，每個濃度3個平行，24 h后測定菌株的生長和鐵載體產(chǎn)量SU。

Z158在Fe3+終濃度為0和100 μmol/L條件下的發(fā)酵液上清以20%的體積加入到已接種指示菌的液體MKB培養(yǎng)基中，同時以只接種指示菌的液體MKB培養(yǎng)基為對照，每組3個平行，16 h后測定指示菌的生長狀況OD［11］。

600

1.2.5 不同培養(yǎng)基對菌株Z158鐵載體產(chǎn)量的影響 MKB培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、SM培養(yǎng)基和AM培養(yǎng)基，4種常用于鐵載體產(chǎn)生的培養(yǎng)基，同時以LB培養(yǎng)基作對照培養(yǎng)Z158，每組3個平行，24 h后測定Z158在不同培養(yǎng)基中鐵載體產(chǎn)量SU。

1.2.6 菌株Z158對不溶性未定型鐵氧化物的利用實驗 每升培養(yǎng)基中添加1 g 8-羥基喹啉，充分混勻后加入500 mL氯仿萃取8-羥基喹啉，上層無色透明溶液即是無鐵SM培養(yǎng)基［14］。在無鐵SM培養(yǎng)基中分別加入3種不同形式的鐵源，即0.1 g/L不溶性PCIH粉末、終濃度為1 μmol/L Fe3+和終濃度為1 μmol/L EDTA-Fe3+，同時以無鐵培養(yǎng)基為對照，每組3個平行，12 h和24 h時測定Z158生長情況和鐵載體產(chǎn)量。

本實驗使用到的玻璃器皿均用濃鹽酸溶液過夜浸泡，然后去離子水清洗3遍。實驗中避免使用鐵制器械，接種采用鉑金絲接種針。

2 結(jié)果

2.1 高產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

利用MSA-CAS平板從土壤樣品中共分離到172株產(chǎn)生鐵載體的菌株，PSSP（Potentially strong siderophore producers）菌株有13株，BSP（Borderline siderophore producers）菌株有159株。進(jìn)一步用液體CAS方法定量測定了分離菌株的鐵載體產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)BSP菌株的SU值均在60%以下，與MSA-CAS平板上BSP菌株的顏色變化緩慢一致；13株P(guān)SSP菌株產(chǎn)生鐵載體的能力均為++++，其中菌株Z13鐵載體產(chǎn)量最大，SU=74.6%（表1）。

表1 分析PSSP菌株產(chǎn)鐵載體的水平

2.2 PSSP菌株對常見致病菌的抑制作用

采用瓊脂擴(kuò)散法分析分離菌株的抑菌能力，結(jié)果顯示，13株P(guān)SSP菌株中，10株對普通變形桿菌有抑制作用，2株對金黃色葡萄球菌有抑制作用，1株對副溶血性弧菌有抑制作用，1株對藤黃微球菌有抑制作用。其中菌株Z158對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、普通變形桿菌和副溶血性弧菌4種指示菌都有明顯的抑制作用，抑菌圈大小分別為15.0 mm、13.8 mm、10.1 mm和8.9 mm。根據(jù)抑菌數(shù)據(jù)，選擇菌株Z158作進(jìn)一步分析。

菌株Z158在含有0 μmol/L和100 μmol/L Fe3+的培養(yǎng)基中鐵載體產(chǎn)量分別為70.8%和19.9%，將兩種不同鐵載體含量的無細(xì)胞上清分別與4種致病菌分別混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示低鐵載體含量上清幾乎無抑制作用，高鐵載體含量上清對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、普通變形桿菌和副溶血性弧菌的抑菌率分別為51.3%、50.2%、37.1%和28.0%（圖1）。

圖1 菌株Z158不同含量的鐵載體對致病菌的抑菌率

2.3 菌株Z158的分子鑒定

根據(jù)材料與方法所述，擴(kuò)增菌株Z158的16S rRNA基因片段，測序后得到擴(kuò)增的基因片段長度為1 418 bp，上傳至GenBank獲得的登錄號為KP322019。通過Blast檢索，與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與Pseudomonas aeruginosa ALK319同源程度為100%。為了進(jìn)一步對分離菌株進(jìn)行分類，利用16S rRNA專業(yè)網(wǎng)站Ribosomal Database ProjectⅡ提供的工具Classifier，對Z158的序列進(jìn)行分析，鑒定該分離菌株與銅綠假單胞菌的同源程度為100%。構(gòu)建Z158系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），Z158與P. aeruginosa ATCC15692、P. aeruginosa PAO1、P. aeruginosa 4EA和P. aeruginosa ALK319的同源程度高，遺傳差異??；其中P. aeruginosa PAO1是典型模式菌株，能產(chǎn)生對Fe3+高親和力的膿青素（Pyoverdine）；從印度果阿邦分離到的P. aeruginosa 4EA可產(chǎn)生pyochelin和pyoverdine兩種鐵載體。綜合以上結(jié)果，鑒定Z158屬于銅綠假單胞菌。

圖2 Z158系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 不同培養(yǎng)基對菌株Z158鐵載體產(chǎn)量的影響

菌株Z158在5種含有不同碳氮源和微量元素的培養(yǎng)基中的生長和鐵載體產(chǎn)量不同，從表2可知，Z158在營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基上生長最好，但鐵載體含量最低，說明LB適合菌株生長卻不適合鐵載體的產(chǎn)生；SM、MSA和AM培養(yǎng)基都適合Z158的鐵載體產(chǎn)生，綜合OD600和SU，我們選擇SM培養(yǎng)基作為菌株Z158最適產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對Z158生長狀況和鐵載體產(chǎn)量的影響

圖3 Fe3+濃度對鐵載體產(chǎn)量的影響

鐵載體在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)量不同，可能是培養(yǎng)基中Fe3+濃度的差異造成的。在SM培養(yǎng)基中添加不同濃度的Fe3+，分析鐵載體的產(chǎn)量。結(jié)果如圖3所示，隨著培養(yǎng)基中Fe3+濃度的增加，菌株Z158的鐵載體產(chǎn)量下降，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到5 μmol/L時，SU降低至17.2%；同時我們還觀察到，菌株Z158的鐵載體在隨著Fe3+濃度增加而減少時培養(yǎng)基的顏色也發(fā)生變化，隨著Fe3+濃度的增加黃綠色變淺，當(dāng)Fe3+濃度為5 μmol/L以上時，培養(yǎng)基顏色為白色且不再發(fā)生變化。

2.5 菌株Z158對不溶性未定型鐵氧化物（PCIH）的利用

鐵載體的功能之一是螯合環(huán)境中的不溶性鐵，為微生物和植物生長所利用。我們在實驗室制備了未定型鐵化合物PCIH，分析菌株Z158的生長狀況。結(jié)果如圖4所示，菌株Z158在含有0 μmol/L Fe3+、1 μmol/L Fe3+、1 μmol/L EDTA-Fe3+和PCIH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h時OD600分別是0.28、0.56、0.53和0.34；24 h時OD600分別為0.24、0.62、0.59和0.36。結(jié)果顯示，不溶性PCIH能夠明顯促進(jìn)菌株Z158的生長，菌株Z158合成分泌的鐵載體能夠通過溶解螯合作用，從不溶性鐵化合物中獲取鐵元素。

圖4 菌株Z158在不同鐵源下的生物量

制備無鐵培養(yǎng)基時，殘留的微量8-羥基喹啉會影響CAS反應(yīng)的顏色，造成檢測鐵載體存在誤差。研究顯示，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鐵載體在400 nm左右具有特異吸收峰。我們對發(fā)酵液的上清進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在402 nm處也存在特異吸收峰。因此通過測定OD402初步分析發(fā)酵液中鐵載體的含量。結(jié)果如圖5所示，在含有PCIH培養(yǎng)基中，鐵載體含量較高，僅次于含有1 μmol/L EDTA-Fe3+的培養(yǎng)基。

圖5 菌株Z158在不同鐵源下的鐵載體產(chǎn)量

3 討論

土壤中含有多種微生物能合成鐵載體，本研究篩選到的172株產(chǎn)鐵載體菌株，其中PSSP菌株有13株，BSP菌株有159株。進(jìn)一步用液體CAS方法定量測定分離菌株的鐵載體產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)PSSP菌株的SU值均在60%以上。Pseudomonas.fluorescens sp-f是目前發(fā)現(xiàn)的鐵載體產(chǎn)量最大的假單胞菌株，SU值高達(dá)90.0%［11］，但菌株的SU值和對致病菌的抑制效果不具有線性關(guān)系，也就是說即使SU值很大，也有可能無抑菌作用［15］。例如，從稻田中篩選的能有效地抑制Sarocladium oryza的生長，但SU只有70%左右［16］。文獻(xiàn)報道鐵載體的抑菌機(jī)制主要是：（1）病原菌自己不產(chǎn)生鐵載體或產(chǎn)生量小，不能與鐵結(jié)合或結(jié)合能力很弱；（2）生防菌可以利用病原菌產(chǎn)生的鐵載體，而病原菌不能利用生防菌產(chǎn)生的鐵載體［17］。而且假單胞菌屬分泌pyoverdine鐵載體，該鐵載體不能被本屬以外的其他菌株吸收利用，使得假單胞菌在生物防控方面具有很大的優(yōu)勢。本研究篩選到的13株P(guān)SSP菌株，只有P. aeruginosa Z158產(chǎn)生的鐵載體對4種常見致病菌都有抑制作用。

鐵是微生物正常生長所需要的一種重要微量元素，當(dāng)鐵營養(yǎng)供給不足，微生物的生長也受到限制，因此可通過微生物的生長情況反映微生物對不同形式鐵源的利用效果［2］。當(dāng)鐵以不溶性礦物質(zhì)形式存在時，微生物產(chǎn)生的鐵載體對不溶性鐵礦物質(zhì)中鐵的溶解度和溶解速率極其重要［18］。交替單胞菌Alteromonas haloplanktis產(chǎn)生的鐵載體在pH 4.0、ICC=12.9 μmol/L時，使針鐵礦和PCIH的溶解速率增大至9.5 nmol/h/m2和3.4 nmol/h/m2［8］；門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina在無鐵對照、天然含鐵的高嶺土和30 μmol/L EDTA-Fe3+中的OD600逐漸增加，但每個細(xì)胞分泌的鐵載體產(chǎn)量卻逐漸降低［19］。本研究中，菌株Z158在PCIH為唯一鐵源的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)生高于無鐵對照的鐵載體量促進(jìn)PCIH中的鐵元素的溶解，使12 h和24 h下OD600比無鐵條件分別升高了26.6%和46.1%，說明Z158產(chǎn)生的鐵載體能促進(jìn)不溶性PCIH中的鐵溶解，進(jìn)而為自身生長利用。

4 結(jié)論

本研究篩選到的P. aeruginosa Z158產(chǎn)生的鐵載體可促進(jìn)不溶性鐵化合物的溶解，能夠為自身和一些植物的生長提供鐵營養(yǎng)，同時還能抑制致病菌的生長，菌株Z158可作為潛在的生防菌株用于植物疾病防控和促進(jìn)植物的生長。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of Pseudomonas Strains Producing High-yield Siderophore and Its Utilization of Iron Hydroxides

Zhu Huiming1Zhang Yan2Yang Hongjiang1
（1. College of Biotechnology in Tianjin University of Science and Technology，Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Tianjin300457；2. Tianjin Shuanglian Kexin Biotechnology Co.，Ltd，Tianjin300453）

The aim of this study is to isolate the microorganisms producing high-yield siderophore， investigate antimicrobial activity of siderophore against pathogenic bacteria， and study the effect of siderophore on the utilization of insoluble poorly crystalline iron hydroxides（PICH）. CAS method was used for isolating microorganisms producing high-yield siderophore. Agar diffusion method and growth inhibition assay were used to test antimicrobial activities of siderophore. Sequence alignment of 16S rRNA gene was used for strain identification. Bacterial growth was measured to investigate the utilization of insoluble PCIH by siderophore. Totally， 172 siderophore-producing strains were isolated from soil samples， including 13 potentially strong siderophore producers（PSSP）. The analysis of antimicrobial activities of siderophore showed that only the supernatant of Z158 culture had a pronounced inhibiting effect on the growth of Staphylococcus aureus， Micrococcus luteus， Proteus vulgaris， and Vibrio parahemolyticus， and the inhibition efficiency was 51.3%， 50.2%， 37.1%， and 28.0%， respectively. Homology analysis of 16S rRNA gene sequence identified strain Z158 as Pseudomonas aeruginosa. Moreover， with insoluble PICH as sole iron source， the biomass of Z158 increased by 46.1% at 24 h after incubation. In conclusion， the siderophore secreted by P. aeruginosa Z158 could inhibit the growth of pathogenic bacteria and acquire iron element from insoluble PCIH.

siderophore；Pseudomonas aeruginosa；antimicrobial activity；poorly crystalline iron hydroxides

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.025

2014-12-24

由天津市科技支撐計劃重點項目（13ZCZDNC00600）

朱慧明，女，碩士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：zhm15903855271@163.com

楊洪江，男，博士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：hongjiangyang@tust.edu.cn