高溫脅迫誘導(dǎo)對(duì)白樺懸浮細(xì)胞三萜積累及防御酶活性的影響

常志凱白祎杰董恒尹靜詹亞光，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150040；2.東北林業(yè)大學(xué)　林木遺傳育種與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150040）

高溫脅迫誘導(dǎo)對(duì)白樺懸浮細(xì)胞三萜積累及防御酶活性的影響

常志凱1白祎杰1董恒1尹靜1詹亞光1，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

通過(guò)研究不同高溫脅迫下白樺細(xì)胞的細(xì)胞活力，防御酶活性和總?cè)坪康淖兓?，確定誘導(dǎo)白樺細(xì)胞合成三萜的最適高溫脅迫條件。35℃、40℃、45℃、50℃和55℃脅迫白樺細(xì)胞1、2和4 h，測(cè)定其細(xì)胞活力，防御酶（SOD、CAT和PAL）活性和總?cè)坪?。結(jié)果顯示，45-55℃高溫脅迫下，細(xì)胞活力顯著下降，以50℃ 2 h處理下降最顯著，是對(duì)照細(xì)胞活力的6.8%；SOD和PAL活性顯著增加，以55℃ 4 h處理后24 h時(shí)SOD和PAL活性最高，分別較對(duì)照提高164.9%和159.6%；CAT活性受到抑制，以55℃ 2 h和4 h處理在12 h后取樣最低。50℃處理2 h后24 h取樣，細(xì)胞總?cè)坪孔罡?，濃度?6.66 mg/g，比對(duì)照提高105.6%。最終確定50℃脅迫2 h后24 h取樣為利用高溫脅迫誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞合成三萜類物質(zhì)的最適溫度脅迫條件。

白樺；防御酶；三萜；溫度脅迫

白樺（Betula platyphylla Suk），樺木科樺木屬植物，落葉喬木，廣泛分布于我國(guó)東北黑龍江省內(nèi)，具有重要的生態(tài)價(jià)值和工業(yè)價(jià)值。研究證明，從白樺樹(shù)皮中提取出的三萜類物質(zhì)主要成分有白樺酯醇、白樺酯酸及樺葉烯三醇、樺葉烯四醇等，在殺死癌細(xì)胞、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)人體免疫機(jī)能等方面都具有良好作用［1］。

影響植物次生代謝的因素有許多，如溫度、機(jī)械損傷、紫外線和化學(xué)試劑等，其會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生各種脅迫，促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成［2］。Zu等［3］發(fā)現(xiàn)喜樹(shù)幼苗在38-40℃脅迫中10-羥基喜樹(shù)堿合成顯著提高；李波等［4］研究不同條件對(duì)苜蓿愈傷組織異黃酮含量的影響，結(jié)果表明，在20℃、25℃、30℃和35℃的溫度脅迫中，以25℃和30℃下苜蓿愈傷組織中異黃酮積累最高，含量分別為0.497%和0.570%。以上研究證明，適當(dāng)?shù)母邷孛{迫可以顯著誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。

環(huán)境脅迫（如高溫）促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累過(guò)程大致為，先激活細(xì)胞表面受體，引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，然后調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝途徑，激活相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，最終引起次生代謝產(chǎn)物的積累［5］。目前發(fā)現(xiàn)在植物受到高溫脅迫時(shí)，多種信號(hào)分子如水楊酸（SA）、鈣離子（Ca2+）、脫落酸（ABA）、一氧化氮（NO）、過(guò)氧化氫（H2O2），在體內(nèi)含量顯著增加［6］。徐茂軍等［7］在高溫處理金絲桃細(xì)胞誘導(dǎo)金絲桃素生物的研究發(fā)現(xiàn)，40℃處理10 min可誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中金絲桃素的生物合成，并促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生NO和H2O2，表明在高溫脅迫下通過(guò)信號(hào)分子NO和H2O2協(xié)同作用，共同促進(jìn)金絲桃素的合成。此外，高溫脅迫還會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累過(guò)高，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)相關(guān)關(guān)鍵防御酶啟動(dòng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL），共同抵御因高溫脅迫對(duì)細(xì)胞造成的傷害［8-11］。

關(guān)于利用溫度脅迫誘導(dǎo)白樺細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)研究報(bào)道不多，本課題組趙微等［12］已發(fā)現(xiàn)50℃ 1 h處理白樺懸浮細(xì)胞2 d后白樺總?cè)坪铣奢^對(duì)照提高了36.4%，防御酶（SOD、CAT、PAL）活性也有不同程度增加。郝征等［13］用高溫脅迫對(duì)白樺幼苗生理生化指標(biāo)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，37℃處理和42℃處理可顯著提高SOD活性和超氧陰離子的積累，且42℃較37℃處理更為顯著，表明適度的高溫脅迫能激活SOD活性。本研究在趙微等［12］研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)脅迫溫度處理，通過(guò)研究白樺細(xì)胞的細(xì)胞活力，防御酶（CAT、SOD、PAL）活性和總?cè)频暮孔兓?，初步探索高溫脅迫與白樺莖段懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物三萜的合成的關(guān)系，期望獲得最適的高溫處理?xiàng)l件，以提高利用白樺莖段懸浮細(xì)胞合成三萜類物質(zhì)的產(chǎn)量，為白樺懸浮細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的大規(guī)模培養(yǎng)及高效獲得白樺三萜提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以長(zhǎng)勢(shì)良好的白樺莖段懸浮細(xì)胞為材料。采用100 mL的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中倒入50 mL NT液體培養(yǎng)基，加入3 g白樺懸浮細(xì)胞，搖床中懸浮培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 液體培養(yǎng)基：NT培養(yǎng)基并在每升培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L的6-BA 100 μL，0.01 mg/L的TDZ 10 μL，蔗糖20 g和酸水解酪蛋白2 g，最后將pH值調(diào)至6.5左右。將配制好的NT培養(yǎng)基倒入100 mL的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶倒入50 mL NT培養(yǎng)基，封口膜封好，在121℃高壓蒸汽鍋滅菌20 min。每瓶培養(yǎng)基接種3 g白樺懸浮細(xì)胞，在培養(yǎng)溫度為24-26℃，光強(qiáng)為2 000 lx，光照時(shí)間24 h/d，濕度為40%-50%，搖床轉(zhuǎn)速116 r/min的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 高度脅迫處理 處理溫度設(shè)置為5個(gè)水平：35℃、40℃、45℃、50℃和55℃。處理時(shí)間設(shè)置為3個(gè)水平：1、2和4 h，分別在處理后的0、6、12、24、48和72 h取樣。在定量分裝好的白樺懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的第7天時(shí)進(jìn)行溫度處理，并每組重復(fù)3次。在處理后各取樣點(diǎn)時(shí)間（0、6、12、24、48和72 h）收獲細(xì)胞，每組細(xì)胞分為兩份，一份測(cè)量其細(xì)胞活力，防御酶（超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT、苯丙氨酸裂解酶PAL）的活性，一部分放入65℃烘箱烘干至恒重后，研磨成粉狀，測(cè)量細(xì)胞總?cè)频暮俊?/p>

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 SOD、PAL及CAT酶活性測(cè)定 采用李和生［14］的方法。

1.2.3.2 細(xì)胞活力采用TTC法測(cè)定 參考黃純農(nóng)［15］的方法。

1.2.3.3 白樺總?cè)茰y(cè)定 參考趙微等［12］的方法。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫對(duì)白樺細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力是生長(zhǎng)狀態(tài)和受脅迫程度的指標(biāo)。高溫脅迫下白樺細(xì)胞中細(xì)胞活力大小如圖1所示，在35-55℃ 5個(gè)梯度、0-72 h 6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的處理?xiàng)l件下，發(fā)現(xiàn)白樺細(xì)胞隨取樣時(shí)間延長(zhǎng)和處理溫度的提高，白樺細(xì)胞的細(xì)胞活力呈逐漸降低趨勢(shì)。40-55℃處理1、2和4 h后0-72 h間細(xì)胞活力下降較顯著，其中50℃處理1 h、2 h和4 h后72 h取樣時(shí)細(xì)胞活力下降最為顯著，細(xì)胞活力值分別為0.154、0.10和0.003，是對(duì)照的0.69倍、0.05倍和0.01倍，比50℃處理1、2和4 h后0 h取樣時(shí)分別下降了63.9%、85.6%和95.3%；35℃處理1、2和4 h后在0-48 h間細(xì)胞活力下降不顯著，在處理72 h后細(xì)胞活力明顯降低，其中35℃處理1、2和4 h后細(xì)胞活力值為0.288、0.378和0.383，分別為對(duì)照的1.29倍、1.70倍和1.72倍，較35℃處理1、2和4 h后0 h取樣分別下降了82.2%、77.4%和77.0%（圖1）。40-55℃脅迫下，細(xì)胞活力下降顯著，初步推測(cè)此溫度脅迫下可能有利于誘導(dǎo)植物次生代謝轉(zhuǎn)化增強(qiáng)。

圖1 高溫脅迫對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.2 高溫脅迫對(duì)白樺細(xì)胞防御酶活力的影響

高溫脅迫下，細(xì)胞H2O2含量上升會(huì)破壞膜穩(wěn)定性，CAT可以有效分解 H2O2從而降低H2O2對(duì)膜系統(tǒng)的損害，是植物抗逆性的重要指標(biāo)。高溫脅迫下白樺細(xì)胞中CAT活性（圖2）顯示，在35-55℃共5個(gè)梯度、0-72 h共6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的處理?xiàng)l件下，發(fā)現(xiàn)白樺細(xì)胞CAT活性在35℃和40℃處理1、2和4 h后CAT活性呈現(xiàn)先下降后增加，最后逐漸降低的趨勢(shì)。其中，在0-24 h取樣CAT活性較對(duì)照顯著增加，以35℃和40℃處理1 h后在6 h取樣，CAT活性提升最為明顯，分別較對(duì)照提高338.9%和372.2%；48 h后CAT活性普遍低于對(duì)照，以40℃ 1 h處理72 h后取樣CAT活性最低，較對(duì)照下降54.2%（圖2-A）。45-55℃ 1、2和4 h處理后CAT活性呈先降低后逐漸增加趨勢(shì)，且顯著低于對(duì)照；在相同溫度下隨著處理時(shí)間的增加，CAT活性下降顯著，以55℃ 2 h和4 h處理在12 h后取樣最低，CAT活性為0（圖2-B和2-C）。結(jié)果表明，35-40℃脅迫后CAT變化趨勢(shì)與對(duì)照基本一致，且在0-24 h內(nèi)能顯著誘導(dǎo)CAT活性增加；在45-55℃脅迫下CAT活性則被顯著抑制。

SOD主要將超氧陰離子歧化后生成H2O2，可有效地清除因高溫引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累。高溫脅迫后白樺細(xì)胞中SOD活性如圖3所示，在35-55℃的5個(gè)梯度、0-72 h的6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的處理?xiàng)l件下，發(fā)現(xiàn)白樺細(xì)胞SOD活性在35℃處理1、2和4 h后呈先增加后逐漸降低的趨勢(shì)，且較對(duì)照無(wú)顯著增加；40-55℃處理1、2和4 h 后均在24-48 h間達(dá)到峰值，且較對(duì)照顯著增加，以55℃處理1 h和2 h后24 h取樣時(shí)SOD活性最高，分別較對(duì)照提高60.4%和140.3%；50℃處理1 h和45℃ 2 h在48 h取樣時(shí)SOD活性最高，分別較對(duì)照提高357.7%和116.3%。結(jié)果表明，35℃處理后SOD活性變化趨勢(shì)與對(duì)照基本一致，且SOD活性無(wú)顯著提高；較高的溫度脅迫（40-55℃）后在24-48 h內(nèi)可以顯著誘導(dǎo)SOD活性的提高。

圖2 高溫脅迫對(duì)CAT活性的影響

PAL是苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶和限速酶，此途徑可產(chǎn)生許多具有天然藥物活性的次生代謝產(chǎn)物。高溫脅迫后白樺細(xì)胞中PAL活性（圖4）顯示，在35-55℃的5個(gè)梯度、0-72 h的6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的處理?xiàng)l件下，發(fā)現(xiàn)40-55℃處理1、2和4 h后白樺細(xì)胞細(xì)胞PAL活性呈先下降后增加，最后逐漸降低的趨勢(shì)，以50℃處理1 h、2 h與55℃處理4 h在24 h取樣時(shí)PAL活性最高，分別較對(duì)照提高246.2%、246.2%和259.6%；35℃較40-55℃處理下PAL活性增加不顯著，以35℃處理4 h后0 h取樣下活性較對(duì)照提升最高，但僅提高13.3%（圖4-C）。結(jié)果表明，50℃和55℃脅迫后24 h能顯著誘導(dǎo)PAL活性增加，而35℃對(duì)PAL活性的提高無(wú)顯著影響。

圖3 高溫脅迫對(duì)SOD活性的影響

2.3 高溫脅迫對(duì)白樺細(xì)胞總?cè)坪康挠绊?/p>

白樺細(xì)胞中總?cè)坪咳鐖D5所示，50℃和55℃處理下白樺細(xì)胞的總?cè)坪肯啾葘?duì)照提高最為顯著，45℃處理次之，35-40℃的溫度處理中，總?cè)坪枯^對(duì)照無(wú)顯著增加。50℃處理2 h、4 h與55℃處理2 h后的24 h取樣時(shí)細(xì)胞總?cè)坪枯^高，含量分別為76.66、68.63和73.24 mg/g，分別較對(duì)照提高105.6%、84.03%和96.4%（圖5-B和5-C）。

3 討論

高溫脅迫會(huì)對(duì)植物正常代謝產(chǎn)生一系列損傷，主要會(huì)引起細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，細(xì)胞膜流動(dòng)性增大，導(dǎo)致細(xì)胞液外滲，從而對(duì)細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生不利影響［16］。細(xì)胞活力是衡量植物細(xì)胞新陳代謝活力的重要指標(biāo)，本研究中在溫度35℃和對(duì)照（25℃）中，細(xì)胞活力在24 h短暫上升，并隨取樣時(shí)間的延長(zhǎng)，呈逐漸降低趨勢(shì)，這一點(diǎn)與劉華［17］在紅豆杉細(xì)胞活力與生長(zhǎng)周期關(guān)系的研究結(jié)果基本一致；而本研究中40-55℃處理下白樺細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照。

圖4 高溫脅迫對(duì)PAL活性的影響

高溫脅迫還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加，從而啟動(dòng)防御酶SOD，CAT，清除氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)的活性氧平衡，抵御高溫對(duì)細(xì)胞造成的損傷［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)在45-55℃ 1、2和4 h處理后CAT活性先在0-12 h呈下降趨勢(shì)，之后再呈緩慢上升趨勢(shì)，在35-40℃脅迫下的0-12 h，細(xì)胞CAT活性顯著高于對(duì)照；35-40℃脅迫下能誘導(dǎo)白樺細(xì)胞CAT活性不同程度的增加，而在45-55℃脅迫下則顯著抑制CAT活性，且抑制程度隨高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，與李忠光等［21］對(duì)CAT活性研究結(jié)果類似。在40-55℃處理下白樺細(xì)胞SOD活性在24-48 h均逐漸達(dá)到峰值，然后下降，且比對(duì)照顯著增加，而35℃處理下，SOD活性無(wú)顯著提升，表明在40-55℃脅迫條件下SOD活性顯著增加，與趙微等［12］和馬寶鵬等［22］對(duì)SOD酶活性的研究結(jié)果類似。

PAL是合成許多具有天然藥用活性成分次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，其活性的增加也能提高植物細(xì)胞對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性［23，24］。本研究在50℃和55℃處理下PAL活性較對(duì)照提升最為顯著，且此時(shí)白樺細(xì)胞總?cè)坪恳草^高，表明在50℃和55℃高溫脅迫誘導(dǎo)PAL活性增加，且PAL可能在白樺三萜合成中起到關(guān)鍵作用。張長(zhǎng)平等［25］在南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，加入真菌誘導(dǎo)子，從而引起PAL活性提高，萜類物質(zhì)合成得到加強(qiáng)，紫杉醇的產(chǎn)量得到顯著提高，與本研究結(jié)果相似。

圖5 高溫脅迫對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>

在趙微等［12］的研究中已發(fā)現(xiàn)在50℃處理1 h能夠顯著誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞三萜類物質(zhì)的合成與積累，本研究在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)高溫脅迫條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)50℃和55℃處理2 h后24 h取樣時(shí)白樺細(xì)胞總?cè)坪坑休^高積累；細(xì)胞活力顯著下降；PAL和SOD活性增加，可能在50-55℃高溫脅迫下，由于溫度過(guò)高對(duì)白樺細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞加劇，且在細(xì)胞內(nèi)積累了大量活性氧，激活植物防御酶反應(yīng)，引起PAL和SOD活性顯著增加，CAT活性可能由于SOD產(chǎn)物H2O2濃度過(guò)高而被抑制，對(duì)細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝造成不利影響，促進(jìn)細(xì)胞初生代謝向次生代謝轉(zhuǎn)換，從而誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞總?cè)莆镔|(zhì)的合成與積累顯著增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究最終確定50℃脅迫2 h后24 h取樣為利用高溫脅迫誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞合成三萜類物質(zhì)的最適溫度脅迫條件，同時(shí)此溫度脅迫下不同程度地刺激了CAT、SOD、PAL活性變化及細(xì)胞活力大小，表明在高溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的防御酶協(xié)同作用，共同抵御高溫脅迫對(duì)白樺細(xì)胞造成的傷害，并誘導(dǎo)白樺次生代謝產(chǎn)物三萜的合成。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Effects of High Tem perature Stress on the Accumulation of Triterpenoid and the Activity of Defense Enzyme in the Suspension Cells of Birch

Chang Zhikai1Bai Yijie1Dong Heng1Yin Jing1Zhan Yaguang1，2
（1. College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin150040；2. State Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology，Northeast Forestry University，Harbin150040）

This work aims to study how the high temperature stress affects the cell vitality， the activity of defense enzyme and the contents of total triterpenoid in the suspension culture cells of birch， and determine the optimal heat stress treatment by which birch cells can be induced to synthesize triterpenoid. We set temperature of 35℃， 40℃， 45℃， 50℃ and 55℃ treating birch cells for 1， 2 and 4 h respectively，then measured the cells’ vitalities， the activities of defense enzymes’（SOD， CAT and PAL）， and the contents of total triterpenoid. Under the treatments of 45-55℃， cell’s vitality reduced significantly， and at 50℃ for 2 h was only 6.8% of the control group；meanwhile， the activities of SOD and PAL increased significantly and reached the highest while treated at 55℃ for 4 h and measured at 24 h， i.e.， they increased 164.9% and 159.6% compared to the control group. However， the CAT activity was strongly inhibited， in lowest while treated at 55℃ for 2 h and 4 h and measured at 12 h. When treated at 50℃ for 2 h and sampled at 24 h， the contents of total triterpenoid were the highest with 76.66 mg/g， increased 105.6% compared to the control. Finally， we determined that the condition of treatment at 50℃ for 2 h and measured after 24 h was the optimal to induce the birch suspension cells to produce the triterpenoid.

birch；defense enzyme；triterpenoid；temperature stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.015

2014-12-24

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目（J1210053），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070531）

常志凱，男，研究方向：植物細(xì)胞工程；E-mail：1014381994@qq.com

詹亞光，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物生物技術(shù)；E-mail：yaguangzhan@126.com