轉基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉雞腸道中的殘留檢測

徐燈耿麗麗張敏紅盧凡張杰

（1.　湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境學院，武漢　430068；2.　中國農業(yè)科學院植物保護研究所　植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京　100193；3.　中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京　100193）

轉基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉雞腸道中的殘留檢測

徐燈1，2耿麗麗2張敏紅3盧凡1張杰2

（1.湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境學院，武漢430068；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193；3.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

旨在研究轉基因水稻對飼喂肉雞的影響，以含有轉cry1Ab/Ac基因水稻的飼料飼喂肉雞，分析了肉雞空腸、回腸、盲腸、直腸中cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留情況，并用體外實驗驗證了外源基因的降解情況。結果表明，飼喂轉cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉雞腸道4個部位中沒有檢測到cry1Ab/Ac基因殘留，體外消化外源基因的實驗發(fā)現(xiàn)外源基因在肉雞腸道中約4 h后開始逐步降解。對上述4個部位內容物進行ELISA和Western blot分析，均未檢測到 Cry1Ab/Ac蛋白殘留。綜合分析表明，轉基因水稻中的外源基因和蛋白在肉雞腸道中易被消化和降解。

轉基因水稻；肉雞；基因及蛋白殘留；體外消化

水稻是我國主要的糧食作物之一，轉基因水稻主要有抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆環(huán)境以及提高水稻品質等多個品種。轉cry1Ab/Ac基因水稻（華恢1號）是華中農業(yè)大學自主培育的對二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等具有較強殺蟲活性的水稻品種［1］，2009年轉Bt抗蟲水稻華恢1號和汕優(yōu)63獲得農業(yè)部頒發(fā)的農業(yè)轉基因生物安全證書（生產應用）［2］，具有廣闊的應用前景。隨著全球轉基因作物的商業(yè)化和大規(guī)模種植［3］，在一定程度上緩解了糧食緊缺的問題，但轉基因作物可能會對動物等非靶標生物或生態(tài)環(huán)境產生一些非預期效應，所以推廣轉基因作物的前提是要確保其安全性。

對轉基因作物的安全性評價主要從環(huán)境和食用安全性兩方面考慮，食品安全性評價包括對營養(yǎng)成分、抗營養(yǎng)因子、毒性、過敏性、抗生素抗性等方面進行全面評估［4］。轉基因作物被動物攝食后消化規(guī)律是否改變，外源基因及蛋白在腸道及糞便中是否殘留，是否存在轉移到重要器官和血液中的風險；如果動物體內有外源基因和蛋白殘留，是否會在人體內積累殘留，這些問題都備受關注。大量的研究發(fā)現(xiàn)飼喂轉Bt基因或抗除草劑基因的玉米肉雞，在空腸、回腸、盲腸和排泄物以及重要內臟和血液無外源基因殘留［5，6］，在肝臟、雞蛋排泄物中均未發(fā)現(xiàn)外源蛋白的殘留［7］。而對轉基因水稻中外源基因和蛋白殘留的報道僅有兩例，發(fā)現(xiàn)肉雞小腸壁、血液、肌肉和脾臟等器官中無cry1Ab基因殘留［8］，在肉雞十二指腸、空腸、回腸內容物和脾臟等器官中無Cry1Ac蛋白殘留［9］；迄今國內外尚無轉cry1Ab/ Ac基因水稻中外源基因及蛋白在肉雞體內殘留研究的報道。

針對目前基因殘留檢測中引物單一、覆蓋率低等問題，本研究在轉基因生物新品種培育科技重大專項的支持下，以飼喂轉Bt基因水稻21 d和42 d的肉雞為材料，采用小片段全覆蓋的策略，分析肉雞腸道內容物中cry1Ab/Ac基因的殘留情況，同時采用ELISA和Western blot兩種方法檢測蛋白殘留，旨在為轉基因水稻安全性評價提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 供試水稻品種為華恢1號轉cry1Ab/Ac基因水稻，親本明恢63為對照組，由華中農業(yè)大學提供。

1.1.2 試劑 實驗所需E. coli DH5α菌株由抗蟲生物技術組保存；pMD19-T載體等購自TaKaRa 公司；PVDF膜購自Pall 公司；QIAamp DNA Stool Mini Kit購自QIGEN 公司，QualiPlate試劑盒購自Envirologix公司。鼠源一抗由本實驗室制備，二抗鼠抗羊lgG HRP購自北京天德悅生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 肉雞飼喂 實驗飼養(yǎng)肉雞日糧配制根據中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T33-2004《雞飼養(yǎng)標準》中肉雞營養(yǎng)需要。一共140只雞分成14組，其中7組飼喂含有轉基因水稻飼料，另7組飼喂對照組水稻飼糧。1-21 d日糧中稻米含量為51.72%，22-42 d稻米含量為56.54%。

在21 d和42 d分別從每個處理中隨機取7只雞，屠宰前使肉雞禁食12 h，放血處理后解剖肉雞，分別取空腸、回腸、盲腸、直腸部位置于離心管中液氮冷凍保存。

1.2.2 肉雞腸道中外源基因殘留檢測 肉雞腸道內容物DNA提取用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒，按照說明書中的方法提取。方法稍作改動，腸道內容物加入1.6 mL Buffer ASL振蕩至均質，加入InhibitEX藥片用于去除雜質和PCR干擾物，加入蛋白酶K去除體系中的蛋白，用無水乙醇沉淀DNA，過QIAamp spin柱洗脫后加入200 μL 超純水。DNA提取后采用DNA定量儀（Thermo公司）測定DNA樣品的濃度，并以OD260-280nm檢測DNA的純度。DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

為了檢測外源基因、水稻內源基因殘留，分別根據cry1Ab/Ac基因以及水稻內源蔗糖磷酸合酶基因SPS（Sucrose phosphate synthase gene，U33175）［10］和淀粉分支酶基因RBE4（Starch branching enzyme，EF055878）［11］、肉雞內源基因卵清蛋白ov基因設計引物25對，其中包括擴增cry1Ab/Ac基因全長引物1對和100 bp小片段引物9對、擴增SPS基因100 bp小片段引物11對、擴增RBE4基因全長引物1對和100 bp小片段引物2對、擴增ov基因引物1對，引物序列及擴增長度，見表1，所有引物由生工生物工程公司合成。

PCR反應設置水空白對照、陽性對照、待測樣品，每個樣品做3個重復。擴增cry1Ab/Ac基因反應條件：94℃ 預 變 性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增SPS、ov基因反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增RBE4基因反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產物4℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應體系，見表2。

表1 引物序列及擴增產物

表2 PCR反應體系

1.2.3 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實驗 cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg加肉雞腸道內容物5 mg以及對照組cry1Ab/Ac基因50 ng和水稻基因組10 μg分別在37℃溫浴0、4、8和12 h，溫浴后的產物用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA，DNA產物用根據cry1Ab/Ac基因所設計的10對引物檢測cry1Ab/Ac基因片段。PCR反應條件同1.2.2，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 肉雞腸道中的外源蛋白殘留檢測 肉雞腸道內容物總蛋白用PBS（pH7.4）緩沖液提取，總蛋白定量采用BCA方法，試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測采用ELISA雙抗夾心法，QualiPlate試劑盒購自美國Envirologix公司，方法按照試劑盒說明書進行，重復3次；其中放置溫度均改為37℃，檢測結果用Western blot驗證。Western blot方法如下：待測樣經過SDS-PAGE分離后轉印至PVDF 膜上，將膜用TBS-T 溶液漂洗后用20 mL 5%脫脂奶粉封閉2 h，加入含一抗（0.5 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，4℃孵育過夜或室溫1 h，加入含鼠抗兔IgG二抗（1 μL）的TBS-T漂洗液15 mL，室溫1 h，每步結束后漂洗膜3次，每次10 min，最后膜用顯色液顯色后拍照。

2 結果

2.1 肉雞腸道中外源基因殘留檢測

圖1 肉雞腸道內容物提取的總DNA中cry1Ab/Ac基因的PCR檢測結果

肉雞腸道內容物經QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取后，DNA定量儀檢測DNA的純度（OD260-280nm）均在1.7-1.9，將DNA樣品用超純水稀釋至40-50 ng/μL，每個樣品取1.0 μL用于檢測。PCR方法分別檢測了肉雞腸道內容物提取的總DNA中cry1Ab/Ac基因全長和9個小片段基因，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，僅能擴增出10個片段的相應正對照，在腸道內容物總DNA中，均未檢測到cry1Ab/Ac基因全長和9個小片段（圖1-A和圖1-B）。同樣，在空腸、回腸、盲腸和直腸內容物提取的總DNA中，也檢測不到水稻內源基因SPS及REB4（圖1-C、D和E）；但所有的內容物總DNA中都可以檢測到肉雞內源ov基因（圖1-F）。

2.2 體外消化cry1Ab/Ac基因模擬實驗結果

從消化時間上看，不加腸道內容物對照處理中12 h仍能擴增出全長cry1Ab/Ac基因；然而，cry1Ab/ Ac基因在加入了腸道內容物后，在4 h就檢測不到全長cry1Ab/Ac基因（圖2-A）；但是在4和8 h時還能檢測出cry1Ab/Ac基因9個小片段，而到達12 h時，9個小片段均無法檢測到（圖2-B）。

圖2 體外消化cry1Ab/Ac基因全長（A）及片段（B）

2.3 肉雞腸道中Cry1Ab/Ac蛋白殘留檢測

ELISA檢測前為避免樣品中的蛋白濃度對檢測結果產生較大影響，先用BCA法對提取的蛋白進行定量，定量至20 μg。用雙抗夾心法對樣品進行檢測，檢測結果如表3所示，檢測結果中21 d、42 d轉基因和非轉基因組中盲腸和直腸樣品21CM、21CZ、21TM、21TZ、42CM、42CZ、42TM和 42TZ出現(xiàn)比較明顯的顯色反應，檢測值表明其中可能存在Cry1Ab/Ac蛋白殘留。

表3 ELISA檢測結果

對ELISA檢測結果中產生顏色反應的樣品進行SDS-PAGE和Western blot分析，結果顯示SDSPAGE電泳圖中在60 kD處42CZ樣品和42TZ樣品存在疑似條帶，但Western blot分析結果表明這兩個樣品中并不存在Cry1Ab/Ac蛋白。

3 討論

家禽腸道中沒有Bt蛋白的結合位點，因此，Bt蛋白不會破壞家禽的腸道繼而影響家禽發(fā)育。但如果轉Bt基因水稻中的外源蛋白不易消化，蛋白殘留可能會對家禽產生致敏性［12］，基因殘留也可能引起其他非預期效應，需要對轉Bt基因水稻的消化情況進行分析。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂轉Bt水稻肉雞腸道中沒有cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留，同時用體外消化實驗進行了進一步的驗證。

針對基因殘留檢測中引物單一、覆蓋率低等問題，本研究采用多對引物同時對cry1Ab/Ac基因全長及基因碎片進行檢測。在饑餓12 h的肉雞腸道內容物中未檢測到cry1Ab/Ac基因的殘留，這與Rossi和Tony的結果是一致的。Rossi［13］在飼喂轉Bt玉米肉雞腸道中發(fā)現(xiàn)外源基因僅在肉雞腸道消化系統(tǒng)的前面部分嗉囊中檢測到，原因是肉雞在這一時間段不可能完全消化掉飼料。本研究中水稻內源基因SPS和REB4與cry1Ab/Ac基因有同樣的降解情況，而Tony等［14］在肉雞腸道空腸之后的部位能檢測到植物內源基因的殘留。為了進一步驗證動物實驗中外源基因在肉雞腸道中的降解情況，本研究進行了體外模擬實驗，結果表明全長cry1Ab/Ac基因在4 h已經降解，而小片段在12 h也降解完全，驗證了在饑餓12 h的肉雞腸道內容物中檢測不到cry1Ab/Ac基因的結果。

圖3 21 d、42 d轉基因和非轉基因飼喂肉雞盲腸和直腸內容物總蛋白的SDS-PAGE分析（A）及W estern blot分析（B）

本研究ELISA實驗中一些非轉基因樣品也出現(xiàn)了明顯顏色反應，這與Chowdhμry［15］和Einspanier［16］的結果相類似，肉雞腸道內容物中一些外源或內源的污染物可能會引起顯色反應，影響實驗的結果。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)樣品中并沒有Bt蛋白殘留［17］，與本研究結果一致。隨著腸道消化吸收食物，在腸道以外部分如雞的蛋［18］、血液［5］、肌肉［19，20］、內臟組織［6，21］、糞便［7］中也未檢測到外源蛋白的殘留。

上述研究充分說明轉基因水稻中的外源基因和蛋白在肉雞腸道內容物中無殘留，本實驗室進一步利用宏基因組16S rDNA測序技術發(fā)現(xiàn)飼喂轉Bt基因水稻對肉雞腸道微生物群落結構無顯著影響（數(shù)據待發(fā)表），當然還需要營養(yǎng)學、毒理學等方面的研究對轉Bt基因水稻食用安全性做出全面的評價。

4 結論

本研究分析了飼喂轉Bt水稻肉雞腸道中外源基因和蛋白的殘留情況，結果顯示，肉雞腸道內容物中沒有cry1Ab/Ac基因和蛋白殘留，該研究體系為其他轉基因作物對動物飼喂安全性評價提供了借鑒。

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（責任編輯 狄艷紅）

Detection of cry1Ab/Ac Gene and Protein Remained in Gut of Broiler Feeding Transgenic Rice

Xu Deng1，2Geng Lili2Zhang Minhong3Lu Fan1Zhang Jie2
（1. School of Resource & Environmental Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan430068；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193；3. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

To analyze the effects of genetically modified rice on feeding broilers， cry1Ab/Ac gene and protein remained in the jejunum，ileum， cecum and rectum of broiler feeding transgenic rice were detected， and the degradation patterns were testified in vitro. The results showed that there were no residues of cry1Ab/Ac gene in 4 intestinal parts of broilers fed transgenic rice for 21 and 42 d， and cry1Ab/Ac gene gradually degraded after 4 h in the gut in vitro test. No residues of Cry1Ab/Ac protein were detected in contents of the above 4 parts of broilers using ELISA and Western blot. In conclusion， cry1Ab/Ac gene and protein of the transgenic rice were easily digested and degraded in broiler intestines.

transgenic rice；broiler；gene and protein residues；digestion in vitro

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.011

2015-01-28

轉基因生物新品種培育重大專項（2012ZX08011001-005）

徐燈，男，碩士，研究方向：轉基因生物安全評價；E-mail：xudg1230@163.com

張杰，男，博士，研究員，研究方向：生防微生物功能基因；E-mail：jzhang@ippcaas.cn盧凡，男，博士，教授，研究方向：藻類生物技術；E-mail：lulab99@gmail.com