M ixture與響應(yīng)面法結(jié)合開發(fā)BHK-21細胞無血清懸浮培養(yǎng)基

汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學　生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海　200237）

M ixture與響應(yīng)面法結(jié)合開發(fā)BHK-21細胞無血清懸浮培養(yǎng)基

汪梁 劉旭平 譚文松

（華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237）

采用Mixture與響應(yīng)面實驗設(shè)計相結(jié)合的方法開發(fā)BHK-21細胞無血清懸浮培養(yǎng)基。在實驗室已知配方的6種培養(yǎng)基A-F的基礎(chǔ)上，通過Mixture實驗篩選出BHK-21細胞無血清培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用響應(yīng)面法針對培養(yǎng)基中的幾種關(guān)鍵組分進行濃度優(yōu)化，確定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和鈣離子的最優(yōu)濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。該無血清懸浮培養(yǎng)基能很好地支持BHK細胞懸浮生長，培養(yǎng)時細胞最大活細胞密度可達140.21×105個/mL，比商業(yè)培養(yǎng)基提高了1.95倍。采用Mixture試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法能夠在較短的時間內(nèi)開發(fā)出適合BHK-21細胞生長的無血清懸浮培養(yǎng)基，為采用BHK-21細胞大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)口蹄疫疫苗奠定了基礎(chǔ)。

BHK-21細胞；無血清懸浮培養(yǎng)基；Mixture實驗設(shè)計；響應(yīng)面分析

口蹄疫是一種無國界傳播的全球性傳染病，可引起巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題，故常被稱為“政治經(jīng)濟病”。其一旦暴發(fā)，能迅速演變?yōu)樯餅?zāi)害。大批的動物被撲殺銷毀，引發(fā)更為嚴重的公共衛(wèi)生問題，容易造成社會的恐慌。對易感動物進行針對性的疫苗接種是控制口蹄疫傳播最有效的措施［1］。

近年來，隨著動物細胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸應(yīng)用于獸用疫苗的生產(chǎn)，動物細胞懸浮培養(yǎng)成為滅活口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）疫苗生產(chǎn)的發(fā)展方向［2，3］。憑借對病毒的高敏感性，BHK細胞自1962年建株以來已成為制備FMD疫苗所需病毒抗原的理想細胞系，被廣泛應(yīng)用于FMD疫苗生產(chǎn)［4，5］。傳統(tǒng)BHK細胞大多采用轉(zhuǎn)瓶低血清貼壁的培養(yǎng)方式［6］。傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)基盡管能向細胞提供生長繁殖所必需的激素、生長因子及其他營養(yǎng)物質(zhì)，但每個批次的血清之間存在批間差異，且血清價格昂貴，容易被病毒和支原體感染［7，8］。此外，血清中大量存在的成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗成品后期的分離純化帶來很大的困難。無血清培養(yǎng)基一般是在傳統(tǒng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加生長因子、鐵轉(zhuǎn)運劑、維生素、微量元素以及植物蛋白水解物等來替代血清成分［9］。開發(fā)無血清懸浮培養(yǎng)基能夠簡化純化和下游加工，降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害，提高了細胞培養(yǎng)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，避免了血清批次之間差異的影響。

Mixture和響應(yīng)面都是基于合理的實驗設(shè)計方法并通過實驗得到一定數(shù)據(jù)進而解決多變量問題的一種統(tǒng)計學方法，被廣泛應(yīng)用于動物細胞培養(yǎng)技術(shù)［10-13］。本實驗在現(xiàn)有6種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上先采用Mixture方法開發(fā)適用于BHK細胞高密度懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，并針對幾種關(guān)鍵成分應(yīng)用響應(yīng)面實驗優(yōu)化其濃度，旨為基于BHK細胞無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本實驗所用的細胞株為敘利亞倉鼠腎細胞系BHK-21（Baby Hamster Kidney cell-21）細胞，由合作企業(yè)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 商業(yè)培養(yǎng)基：由合作企業(yè)提供；6種基礎(chǔ)培養(yǎng)基：從實驗室已知配方的無血清培養(yǎng)基配方庫中挑選出6種培養(yǎng)基，配制結(jié)束后經(jīng)Millipore公司0.22 μm微孔濾膜過濾，并分別命名為A、B、C、D、E和F。其中A、B、C為實驗室自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基，專利號分別為CN201010022834.4、CN201410513086.8和 CN200810039305.8。D、E和F為參考國內(nèi)外與培養(yǎng)基相關(guān)的專利文獻結(jié)合BHK細胞的生長狀況計算獲得的無血清培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)基配方，見表1。

1.1.3 主要試劑 培養(yǎng)基配制所用的試劑中葡萄糖、氨基酸和維生素均購自美國生命技術(shù)公司；各微量金屬鹽類物質(zhì)購自美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖和氨含量測定試劑盒購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；乳酸濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 BHK細胞在實驗培養(yǎng)基中的培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期，活性大于95%的BHK-21細胞移入50 mL離心管中，180×g離心5 min。棄上清，用實驗培養(yǎng)基重懸后加入搖瓶（125 mL，Corning）中，工作體積30 mL，置于130 r/min的搖床，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。每24 h取樣，計數(shù)后1 000×g離心5 min。上清置于-20℃冰箱保存，用于代謝副產(chǎn)物分析。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture實驗設(shè)計 將處于對數(shù)生長期，活性在95%以上的BHK-21細胞接種于125 mL搖瓶，接種方式見1.2.1，工作體積為30 mL。搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，CO2濃度5%，溫度37℃，濕度85%。A-F分別為考察的6種培養(yǎng)基，每個實驗組中各培養(yǎng)基對應(yīng)的數(shù)字為這種培養(yǎng)基在工作體積中所占的體積百分數(shù)。實驗共設(shè)置35個實驗組，其中2個為對照組。其中除對照組以外的實驗組所用培養(yǎng)基由6種培養(yǎng)基混合獲得。對照組的編號為33、34，所用培養(yǎng)基為商業(yè)培養(yǎng)基。接種后每24 h取樣計數(shù)，以最大活細胞密度和IVCC作為實驗的響應(yīng)值，考察響應(yīng)值的大小。實驗設(shè)計方案，見表2。

1.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計與因子最適濃度的確定 Mixture實驗發(fā)現(xiàn)前期谷氨酰胺（Gln）在48 h基本用盡，同時懸浮細胞存在結(jié)團現(xiàn)象。通過查閱文獻，研究發(fā)現(xiàn)Gln不僅是培養(yǎng)基中重要的碳源，還是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸［14-16］。同時鈣離子濃度能夠顯著影響細胞的結(jié)團現(xiàn)象，因此需要考察培養(yǎng)基中Gln和鈣離子的最優(yōu)濃度。此外，牛血清白蛋白（BSA）是血清的重要替代物，酪氨酸（Tyr）也是培養(yǎng)基中對細胞生長狀況有顯著影響的組分［17-20］。為了進一步優(yōu)化培養(yǎng)基，選取Tyr、Gln、BSA和鈣離子，通過在高水平和低水平之間設(shè)置5個濃度梯度，確定4種組分的最佳配比及濃度。利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行模型分析，通過做響應(yīng)曲面圖的方式進行考察。設(shè)計表見表3，其中各水平值1-5分別代表所配制的培養(yǎng)基中各組分對于相應(yīng)濃度的倍率。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方表

實驗編號　A　B　C　D　E　F 1　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083 2 0 0 0 0 1 0 3　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083 4　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083　0.083 5　0　0　0.5　0　0.5　0 6 0 0 0 1 0 0 7 1 0 0 0 0 0 8　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083　0.083 9 0 1 0 0 0 0 10　0.083　0.083　0.083　0.083　0.083　0.583 11　0.083　0.083　0.083　0.583　0.083　0.083 12　0　0.5　0　0　0.5　0 13 0　0　1　0　0　0 14　0　0　0　0　0.5　0.5 15　0　0　0　0.5　0.5　0 16 0　0　0　0　0　1 17 1　0　0　0　0　0 18　0.5　0　0　0　0.5　0 19　0　0.5　0　0　0　0.5 20　0　0　0　0.5　0　0.5 21　0　0　0.5　0.5　0　0 22　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167　0.167 23 0　0　0　0　0　1 24 0　1　0　0　0　0 25 0　0　0　1　0　0 26　0.5　0　0.5　0　0　0 27　0.5　0.5　0　0　0　0 28　0　0　0.5　0　0　0.5 29　0.5　0　0　0.5　0　0 30 0　0　1　0　0　0 31　0　0.5　0　0.5　0　0 32　0　0.5　0.5　0　0　0 33　0.5　0　0　0　0　0.5

編號　Tyr　Gln　BSA　鈣離子1 2 2 4 4 2 2 2 2 2 3 4 4 4 2 4 3 3 3 3 5 3 1 3 3 6 4 4 4 4 7 2 4 4 4 8 4 4 2 4 9 3 3 3 3 10 4　2　4　2 11 3　3　1　3 12 2　4　2　2 13 1　3　3　3 14 4　2　2　4 15 3　3　3　1 16 4　2　4　4 17 2　2　4　2 18 3　3　3　3 19 5　3　3　3 20 2　4　2　4 21 3　3　3　3 22 2　2　2　4 23 2　4　4　2 24 4　2　2　2 25 3　3　3　3 26 3　3　5　3 27 3　5　3　3 28 3　3　3　3 29 4　4　2　2 30 3　3　3　5

1.2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基的驗證 用優(yōu)化后關(guān)鍵組分濃度配制的無血清懸浮培養(yǎng)基在工作體積為30 mL的搖瓶中培養(yǎng)BHK-21細胞，考察并對比細胞在商業(yè)培養(yǎng)基和優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基中的生長及代謝情況。

1.2.5 細胞計數(shù) 由于細胞存在一定結(jié)團的現(xiàn)象，因此計數(shù)前需先用少量胰酶消化5 min。以臺盼藍染色消化好的細胞，用血球計數(shù)板計活細胞數(shù)，并計算活細胞密度和比生長速率。

1.2.6 葡萄糖、氨和乳酸濃度的測定 采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，脲酶-波氏比色法測定氨含量，氧化酶法測定乳酸濃度，均按試劑盒說明書操作。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

（2）活細胞密度對時間積分：IVCC=∫Xvdt（公式2）式中，IVCC（Integral of viable cell concentration over time）為活細胞密度對時間的積分（108cells·d/L）。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture篩選實驗

34種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞最大活細胞密度和IVCC兩組響應(yīng)值，見表4。根據(jù)響應(yīng)值的大小分析6種培養(yǎng)基的不同配比對響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基C對細胞的最大活細胞密度和IVCC的影響顯著強于其他幾種培養(yǎng)基。利用Design-Expert軟件篩選得出BHK-21細胞無血清培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。

表4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Mixture實驗結(jié)果

分析各組分對2個響應(yīng)值的影響后擬合出的線性方程為：最大活細胞密度= 23.67A +11.79B+ 38.30C+34.33D+23.04E+43.63F+14.61AB+132.47 AC-27.36AD+5.14AE+48.41AF+91.41BC+20.77BD +42.67BE+24.74BF+79.23CD+166.93CE+46.40CF +4.09DE+59.57DF+82.07EF；IVCC=114.33A+52.9 6B+154.99C+130.42D+95.06E+149.33F+66.86AB+ 238.42AC-61.05AD-4.23AE+110.29AF+243.46BC+ 164.16BD+152.41BE+121.59BF+347.55CD+624.29 CE+77.22CF+32.65DE+100.95DF +170.36EF。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

利用響應(yīng)面分析方法對Tyr、Gln、BSA和鈣離子進行定量優(yōu)化的結(jié)果，見表5，響應(yīng)面圖見圖1和圖2。以72 h內(nèi)細胞生長獲得的最大活細胞密度和IVCC作為考察對象，對培養(yǎng)基中Gln、Tyr、BSA和鈣離子進行最優(yōu)化分析得出，其最優(yōu)濃度分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相應(yīng)濃度的1倍、4倍、1倍、和1倍，濃度分別為3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。擬合得到多元回歸模型：最大活細胞密度=17.66Tyr +54.95Gln+20.60BSA +3.33Ca2+-1.93TyrGln-3.11Tyr-BSA+2.35TyrCa2+-2.74GlnBSA-2.29GlnCa2+-2.85 BSACa2+-3.78Tyr2-4.63Gln2+1.11BSA2+0.49（Ca2+）2-62.01；IVCC=64.72-15.30Tyr+17.06Gln+5.95BSA-2.60Ca2+-0.07TyrGln-1.86TyrBSA+2.22TyrCa2+-0.68GlnBSA-0.44GlnCa2+-1.70BSACa2++0.30Tyr2-1.66Gln2+1.30BSA2+0.0083（Ca2+）2。

2.3 BHK細胞在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長及代謝情況

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)BHK懸浮細胞，并和商業(yè)培養(yǎng)基中細胞的生長和代謝情況進行對比，結(jié)果如圖3所示。其中圖3-A、圖3-B兩圖為商業(yè)培養(yǎng)基中細胞的生長和代謝情況，圖3-C、圖3-D兩圖為優(yōu)化后培養(yǎng)基中細胞的生長和代謝情況。

生長方面，接種后商業(yè)培養(yǎng)基中細胞幾乎沒有經(jīng)過延滯期即進入對數(shù)生長期，此時比生長速率最大，約為0.75 d-1。隨后比生長速率迅速下降，至108 h細胞比生長速率下降至0 d-1，即進入生長穩(wěn)定期。穩(wěn)定期維持時間很短，之后比生長速率持續(xù)下降，即進入細胞衰亡期。

表5 響應(yīng)面實驗結(jié)果

培養(yǎng)至96 h細胞密度達到最大值，為71.92×105cells/mL，之后細胞密度下降。以最優(yōu)化的Tyr、Gln、BSA和鈣離子濃度配制的無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)BHK懸浮細胞同樣在96 h獲得最大活細胞密度140.21×105cells/mL，約為商業(yè)培養(yǎng)基的1.95倍，較商業(yè)培養(yǎng)基提高了94.95%。此外，優(yōu)化后培養(yǎng)基中細胞的穩(wěn)定期大概能夠維持72 h左右，較商業(yè)培養(yǎng)基延長了48 h。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能夠改善后期細胞的維持狀況，提高細胞可獲得的最大活細胞密度。

代謝方面，商業(yè)培養(yǎng)基中BHK細胞生長過程累積消耗18.88 mmol/L葡萄糖，累積產(chǎn)生乳酸19.47 mmol/L，乳酸對葡萄糖的得率約為1.03 mmol/mmol，整個培養(yǎng)過程共產(chǎn)生氨11.91 mmol/L。而優(yōu)化后培養(yǎng)基中細胞生長過程累積消耗葡萄糖41.16 mmol/L，累積產(chǎn)生乳酸25.27 mmol/L，乳酸對葡萄糖的得率約為0.61 mmol/mmol，整個培養(yǎng)過程共產(chǎn)生氨11.09 mmol/L。對比可見，優(yōu)化后的培養(yǎng)基增加了培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，且乳酸對葡萄糖的得率降為商業(yè)培養(yǎng)基的59.22%，這說明更多的葡萄糖用于細胞的生長。

3 討論

本研究采用了Mixture實驗和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法開發(fā)適于BHK細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。結(jié)果顯示，該組合方法能快速地利用現(xiàn)有的培養(yǎng)基開發(fā)出適合細胞生長的培養(yǎng)基，并能夠針對關(guān)鍵組分進行濃度優(yōu)化進而獲得理想的培養(yǎng)基配方，是一種簡便高效的培養(yǎng)基開發(fā)方法。

通過Mixture實驗以最大活細胞密度和IVCC為考察指標初步篩選出能夠維持BHK細胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并確定6種培養(yǎng)基的混合比例分別為A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。針對Tyr、Gln、BSA和鈣離子進行響應(yīng)面實驗設(shè)計和分析確定4種物質(zhì)的最佳添加比例和濃度，并最終確定一種適合BHK細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。將優(yōu)化后的培養(yǎng)基和商業(yè)培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BHK懸浮細胞最大活細胞密度較商業(yè)培養(yǎng)基提高了94.95%，且乳酸對葡萄糖的得率降為商業(yè)培養(yǎng)基的59.22%。表明該培養(yǎng)基優(yōu)化過程已成功使BHK細胞生長擺脫了對血清的依賴，為采用BHK細胞大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫疫苗奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過Mixture實驗法確定各種培養(yǎng)基的最優(yōu)混合方式，并利用響應(yīng)面法確定關(guān)鍵組分的最優(yōu)濃度，最終開發(fā)出適于BHK細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能改善細胞的生長狀況，符合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

圖1 四種關(guān)鍵組分對BHK細胞最大活細胞密度影響的響應(yīng)面圖

圖2 四種關(guān)鍵組分對BHK細胞IVCC影響的響應(yīng)面圖

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圖3 BHK細胞在商業(yè)培養(yǎng)基和優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長和代謝情況

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（責任編輯 狄艷紅）

Optim ization of Suspended Serum-free M edium for BHK-21 Cells by Combining M ixture w ith Response Surface Analysis

Wang Liang Liu Xuping Tan Wensong
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai200237）

This study is to optimize the suspended serum-free medium for BHK-21 cells by combining Mixture experiment design with response surface analysi（sRSA）. Based on 6 media A-F of known formulation in the laboratory， the optimal combination of the medium with A：B：C：D：E：F = 0：0：11：0：9：0 was screened by the Mixture test. The contents of several key constituents in the medium were optimized by RSA， and the optimal concentrations of glutamine， tyrosine， bovine serum albumin（BSA）and calcium ion were 3 mmol/L， 2.5 g/L， 0 g/L and 0 mmol/L respectively. The serum-free medium effectively supported the suspending growth of BHK cells. The maximum viable cell density of BHK cells in cell suspension culture reached 140.21×105cells/ml， which was 1.95 times in basal medium. The suspended serum-free medium for BHK-21 cells was developed by combining Mixture experiment design with RSA， which lays a foundation for the industrial production of footand-mouth disease（FMD）vaccine while using BHK-21 cells.

BHK-21 cells；suspended serum-free medium；Mixture experiment design；response surface analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.009

2015-06-10

國家自然科學基金項目（21206040，21406066），國家“863”計劃項目（2012AA02A303），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費（WF1214035）

汪梁，女，碩士研究生，研究方向：動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)；E-mail：aaa098503013@163.com

劉旭平，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；譚文松，E-mail：wstan@ecust.edu.cn