綠針假單胞菌HT66中l(wèi)uxR_19對(duì)吩嗪-1-甲酰胺合成的影響

陳亞汶 彭華松 王威 張雪洪

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院　微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?00240）

綠針假單胞菌HT66中l(wèi)uxR_19對(duì)吩嗪-1-甲酰胺合成的影響

陳亞汶 彭華松 王威 張雪洪

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240）

旨在研究調(diào)控基因luxR_19對(duì)綠針假單胞菌HT66中的抑菌物質(zhì)吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）合成及菌體生長(zhǎng)的影響，通過(guò)分子操作構(gòu)建了luxR_19基因敲除株、回補(bǔ)菌株、過(guò)表達(dá)菌株以及l(fā)uxR_19（G85A）點(diǎn)突變菌株，檢測(cè)了目標(biāo)菌株生長(zhǎng)曲線、PCN發(fā)酵結(jié)果、細(xì)菌泳動(dòng)性與從動(dòng)性等。結(jié)果顯示，將luxR_19敲除后PCN產(chǎn)量明顯降低，對(duì)luxR_19基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)CN產(chǎn)量提高2倍；luxR_19對(duì)于吩嗪合成的多個(gè)調(diào)控基因以及合成基因表達(dá)均產(chǎn)生影響；luxR_19的敲除對(duì)HT66的生長(zhǎng)及泳動(dòng)性不產(chǎn)生影響，而對(duì)細(xì)菌的從動(dòng)性有一定的促進(jìn)作用；luxR_19（G85A）點(diǎn)突變菌株吩嗪產(chǎn)量較野生型相差很小。結(jié)果表明，luxR_19對(duì)PCN的合成為正調(diào)控基因，一定程度上影響HT66的從動(dòng)性，第254位堿基突變對(duì)PCN合成產(chǎn)量不產(chǎn)生影響。

綠針假單胞菌；HT66；吩嗪-1-甲酰胺；LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

天然吩嗪類衍生物是一類對(duì)環(huán)境安全、對(duì)植物病原真菌具有廣譜抑菌活性的微生物源抗生物質(zhì)［1］。吩嗪類衍生物種類繁多，主要包括吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、1-羥基-吩嗪（phenazine-1-hydroxy）、2-羥基-吩嗪（phenazine-2-hydroxy，2-OH-PHZ）、吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）等［2］。合成吩嗪類衍生物的微生物主要是假單胞菌和鏈霉菌，綠針假單胞菌被公認(rèn)為是一種安全、有效的植物根際促生菌，除了良好的抑菌作用，還能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，目前仍然沒(méi)有關(guān)于其致病性的相關(guān)報(bào)道，可以認(rèn)為其是一種環(huán)境友好的促生菌［3-5］。據(jù)報(bào)道，許多綠針假單胞菌能夠分泌多種具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如：吩嗪類衍生物、藤黃綠膿菌素、硝吡咯菌素、氫氰酸以及殺蟲(chóng)蛋白P. fluroscent insect toxin D（FitD）等［6，7］。其中，吩嗪類衍生物的分泌是其最為重要的抑菌機(jī)制之一。在前期的研究報(bào)道中，已闡明了綠針假單胞菌中吩嗪生物合成機(jī)理，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)參與吩嗪合成的調(diào)控因子，初步構(gòu)建了吩嗪的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這為利用微生物高效合成吩嗪類物質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)。但吩嗪類物質(zhì)的產(chǎn)量仍然較低，影響了其作為生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)前景，因此，研發(fā)吩嗪類物質(zhì)的高產(chǎn)菌株十分迫切。

Pseudomonas chlororaphis HT66是由本實(shí)驗(yàn)室從上海郊區(qū)水稻根際分離所得。其除了保留綠針假單胞菌的普遍性質(zhì)外，更具有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是其分泌的吩嗪類衍生物幾乎全為PCN。據(jù)報(bào)道，在中性條件下，PCN的抑菌性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCA，為PCA的10倍［4］，其他公開(kāi)報(bào)道的綠針假單胞菌，如GP72、30-84以及O6等菌株，都產(chǎn)生多個(gè)吩嗪類衍生物，包括PCA、2-OH-PHZ［5，8-10］，這使得吩嗪類化合物的分離更為簡(jiǎn)便。二是在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生型HT66菌株，其PCN的產(chǎn)量高達(dá)400 mg/L，高于目前所報(bào)道的各假單胞菌野生型菌株的吩嗪產(chǎn)量，這提供了將其作為構(gòu)建PCN高產(chǎn)菌株的研發(fā)優(yōu)勢(shì)。

在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)HT66進(jìn)行化學(xué)誘變的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)多輪誘變最終得到P3株，其PCN產(chǎn)量達(dá)到了1 597 mg/L，較同一批次發(fā)酵的野生型而言產(chǎn)量提高了3倍［11］。經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)共有244個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中有3個(gè)LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生了突變。LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子多與次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控相關(guān)［12］。在HT66野生株中，共有24個(gè)luxR家族調(diào)控因子，按照3個(gè)突變的luxR基因在基因組中出現(xiàn)的先后順序排列，分別是luxR_13（M217_04406）、luxR_14（M217_04413）和luxR_19（M217_05833），其中l(wèi)uxR_19的第254個(gè)堿基由G突變?yōu)镃，導(dǎo)致第85位氨基酸由Gly突變?yōu)锳la。通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，在第85位氨基酸前后10-20個(gè)氨基酸位點(diǎn)均高度保守，與其活性密切相關(guān)。因此，luxR_19這個(gè)基因是否與吩嗪的合成相關(guān)，其第85位氨基酸的突變是否會(huì)對(duì)吩嗪合成調(diào)控產(chǎn)生影響，是我們首先關(guān)心的問(wèn)題。同時(shí)，菌體的生長(zhǎng)狀況在一定程度上影響到次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，luxR_19是否會(huì)影響到菌株的生長(zhǎng)狀況，同樣值得關(guān)注。

本研究通過(guò)分子操作手段，對(duì)luxR_19基因進(jìn)行敲除，回補(bǔ)以及過(guò)表達(dá)，以研究luxR_19基因?qū)T66合成吩嗪能力的影響，進(jìn)一步通過(guò)luxR_19（G85A）點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建，研究其對(duì)吩嗪合成的影響，旨在為進(jìn)一步了解PCN高產(chǎn)的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建高產(chǎn)PCN菌株打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究中所用到的菌株，質(zhì)粒以及引物見(jiàn)表1和表2。野生型綠針假單胞菌HT66作為構(gòu)建突變菌株的出發(fā)菌株。pK18mobsacB質(zhì)粒用于得到不包含目的片段的基因片段。質(zhì)粒pK18CL用于敲除luxR_19基因。質(zhì)粒pK18CP用于在野生型HT66上獲得點(diǎn)突變菌株。pME6032質(zhì)粒用于構(gòu)建回補(bǔ)以及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。pME-luxR分別用于在野生型HT66中過(guò)表達(dá)luxR_19基因以及在HT66△luxR菌株中回補(bǔ)該基因。

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：10.0 g/L胰蛋白胨，5.0 g/L酵母提取物，10.0 g/L NaCl，固體培養(yǎng)基加入12.0 g/L瓊脂。E. coli的培養(yǎng)溫度為37℃，P. chlororaphis的培養(yǎng)溫度為28℃。

King’s Broth（KB）培養(yǎng)基：20.0 g /L胰蛋白胨，15.0 mL/L甘油，0.514 g/L K2HPO4，0.732 g/L MgSO4，固體培養(yǎng)基加入12.0 g/L瓊脂，用于培養(yǎng)P. chlororaphis，培養(yǎng)溫度為28℃。

抗生素濃度：對(duì)于E. coli：50 μg/mL kanamycin，15 μg/mL tetracycline；對(duì)于P. chlororaphis：50 μg/mL kanamycin，125 μg/mL tetracycline以及100 μg/mL Am-picillin。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒

表2 本研究所用引物序列

泳動(dòng)性（Swimming）實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L NaCl以及3.0 g/L瓊脂糖。

從動(dòng)性（Swarming）實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：5.0 g/L葡萄糖，10.0 g/L胰蛋白胨，5.0 g/L酵母提取物和5.0 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 luxR_19無(wú)痕敲除菌株HT66CL的構(gòu)建 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物L(fēng)A（Xba I）-LB，LC-LD（Hin d III）用于對(duì)luxR_19基因的敲除。利用LA-LB從HT66基因組上擴(kuò)增M217_05833基因上游673 bp，利用LC-LD從HT66基因組上擴(kuò)增luxR_19基因下游791 bp。利用LB與LC之間20 bp的同源片段，通過(guò)融合PCR將兩段基因片段連接在一起。利用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hin d III對(duì)獲得的1.5 kb的融合片段進(jìn)行酶切，將所獲得的片段克隆至pK18mobsacB質(zhì)粒中。所獲得的質(zhì)粒pK18CL首先被轉(zhuǎn)入E. coli S17-1（λpir），之后通過(guò)接合轉(zhuǎn)移至P. chlororaphis HT66中，獲得HT66C1菌株。將HT66C1菌株涂布于含有100 μg/mL Ampicillin（Amp）和50 μg/mL kanamycin（Kan）的LB平板上以篩選出單交換菌株，之后挑選單菌落涂布于含有15%蔗糖的LB平板上以獲得雙交換菌株。獲得的菌株分別點(diǎn)種于含有50 μg/mL Kan的LB平板和無(wú)抗LB平板上，挑選在Kan 50 平板上不生長(zhǎng)，在無(wú)抗LB平板上生長(zhǎng)的菌株，利用PCR以及測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到無(wú)痕敲除luxR_19的菌株HT66CL。

1.2.2 luxR_19基因回補(bǔ)與過(guò)表達(dá) 利用引物L(fēng)F（Eco R I）-LR（Xho I）從野生型HT66基因組中通過(guò)PCR擴(kuò)增luxR_19基因，總長(zhǎng)度為861 bp。利用限制性內(nèi)切酶Eco R I和Xho I同時(shí)對(duì)擴(kuò)增片段以及質(zhì)粒pME6032進(jìn)行酶切，連接得到pME-luxR質(zhì)粒。將pME-luxR質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)化至△luxR以及HT66野生株中，得到回補(bǔ)以及過(guò)表達(dá)菌株。

1.2.3 點(diǎn)突變菌株HT66PM的構(gòu)建 利用引物L(fēng)F（Eco R I）-LR（Xho I）從誘變高產(chǎn)株P(guān)3基因組中利用PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)861 bp的基因片段，通過(guò)酶切連接獲得pK18CP質(zhì)粒。剩余操作同1.2.2，最后通過(guò)測(cè)序篩選得到luxR_19（G85A）點(diǎn)突變菌株HT66PM。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm。將細(xì)菌懸浮液接種于60 mL KB培養(yǎng)基中，確保初始OD600=0.01，28℃，180 r/min培養(yǎng)。每株菌3個(gè)平行。

1.2.5 PCN產(chǎn)量的檢測(cè) 用6 mol/L的HCl將發(fā)酵液調(diào)至pH2.0，加入9倍體積的乙酸乙酯，充分振蕩混勻，6 000 r/min離心5 min分層，PCN轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。取上層萃取液于通風(fēng)櫥中，使有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈。取適量乙腈溶解萃取物，HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中PCN產(chǎn)量。檢測(cè)條件：流動(dòng)相為乙腈-25 mmol/L乙酸銨，色譜柱為WondaSil C18-WR 反相柱（5 μm；4.6×250 mm，Shimadzu，Japan），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，檢測(cè)條件：0-2 min，8%乙腈-92% 25 mmol/L乙酸銨，2-20 min，乙腈濃度從8%升至60%，乙酸銨濃度從92%下降至40%，20-21 min，8%乙腈-92% 25 mmol/L乙酸銨。柱溫30℃，流速1.0 mL/min。

1.2.6 泳動(dòng)性（Swimming）和從動(dòng)性（Swarming）的檢測(cè) 挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中28℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將細(xì)菌懸浮液稀釋至OD600=0.1，取2 μL添加于置于平板中央的無(wú)菌濾紙片。28℃培養(yǎng)24 h。

1.2.7 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 由上海桑尼生物科技有限公司完成，所用引物如表格3所示。內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA，以ΔΔCt值的方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。分別檢測(cè)了HT66以及HT66CL兩株菌的rpeA、phzR、phzI、phzE、rpoS、rpoD、psrA、gacA、gacS以及rsmE基因的相對(duì)表達(dá)量變化情況。

2 結(jié)果

2.1 HT66菌株中l(wèi)uxR_19基因的比對(duì)

將luxR_19基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果（表3和圖1）顯示，luxR_19基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄調(diào)控因子，屬于LuxR家族。比對(duì)還表明luxR_19基因與Pseudomonas protegens CHA0、Pseudomonas sp. UW 4、Pseudomonas fluorescens Pf0-1三株菌的luxR序列相似度較高，在核苷酸水平達(dá)到了80%以上，而與Pseudomonas putida KT2440和Burkholderia cenocepacia J2315相比，相似度僅為69%。進(jìn)一步的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，在第85位氨基酸前后的10-20個(gè)氨基酸序列均具有很高的同源性，高度保守，屬于LuxR_19的活性區(qū)域。

表3 luxR_19基因相似性比對(duì)

圖1 LuxR_19蛋白序列第74-107位氨基酸多序列比對(duì)圖

2.2 重組菌株HT66CL、HT66PM以及HT66/pME-luxR和HT66CL/pME-luxR的構(gòu)建

成功構(gòu)建了pK18CL與pK18PM質(zhì)粒，利用熱激轉(zhuǎn)化導(dǎo)入S17菌株中，之后再通過(guò)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入HT66野生型中，經(jīng)過(guò)兩輪同源重組，最終提取基因組，PCR擴(kuò)增后送上海華大基因公司測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組菌株HT66CL和HT66PM。

構(gòu)建pME-luxR質(zhì)粒，利用電擊轉(zhuǎn)化分別導(dǎo)入HT66以及HT66CL菌株中，從含有四環(huán)素抗性的平板上挑取單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)測(cè)序表明HT66/pME-luxR和HT66CL/pME-luxR構(gòu)建成功。

2.3 luxR_19基因敲除株HT66CL的生長(zhǎng)影響

以HT66野生株為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定luxR_19基因敲除株HT66CL與HT66WT生長(zhǎng)曲線，在28℃，180 r/min的條件下檢測(cè)48 h。結(jié)果（圖2）顯示，HT66CL與HT66的生長(zhǎng)情況十分相似，6 h以前處于適應(yīng)期，約6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，到24 h以后，HT66CL與HT66均進(jìn)入穩(wěn)定期。由此可以推斷，luxR_19基因的敲除對(duì)于HT66菌體生長(zhǎng)情況而言，無(wú)較大影響。

圖2 HT66與HT66CL生長(zhǎng)曲線測(cè)定

同時(shí)，考察了HT66CL菌株的泳動(dòng)性（Swimming）以及從動(dòng)性（Swarming）變化。28℃條件下培養(yǎng)24 h，拍照記錄菌落大小與形態(tài)。Swimming實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3-A和圖3-B）顯示，HT66與HT66CL菌株邊緣均呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落大小相近，無(wú)明顯差異。Swarming實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3-C和3-D）表明，HT66與HT66CL邊緣不規(guī)則且界限模糊，HT66CL形成的生長(zhǎng)圈大小明顯大于HT66。luxR_19基因的敲除未對(duì)HT66的泳動(dòng)能力產(chǎn)生較大影響，可能是由于其基因本身與控制泳動(dòng)能力相關(guān)的基因無(wú)太多作用；luxR_19基因的敲除導(dǎo)致HT66從動(dòng)能力的增加，說(shuō)明其在一定程度上能夠影響或者控制HT66的從動(dòng)能力。

圖3 HT66與HT66CL的泳動(dòng)性及從動(dòng)性

2.4 luxR_19基因?qū)CN產(chǎn)量的影響

圖4 各菌株發(fā)酵24 h后的PCN產(chǎn)量

將HT66、HT66CL以及HT66PM菌株發(fā)酵至36 h，萃取發(fā)酵液，利用HPLC檢測(cè)PCN產(chǎn)量。結(jié)果（圖4）顯示，野生型HT66菌株發(fā)酵至24 h，PCN產(chǎn)量為402.8 mg/L和473.5 mg/L。HT66CL發(fā)酵至24h，PCN產(chǎn)量為153.7 mg/L和198.9 mg/L。就PCN的產(chǎn)量而言，HT66CL比HT66下降了約50%。反觀HT66PM，24 h的PCN產(chǎn)量為387.3 mg/L，整體而言雖然比HT66略有下降，但是下降幅度不明顯，點(diǎn)突變后無(wú)明顯變化。

將 HT66、HT66/pME、HT66/pME-luxR、HT66CL、HT66CL/pME以及HT66CL/pME-luxR菌株接種于大瓶KB培養(yǎng)基中發(fā)酵，培養(yǎng)至OD600=0.1，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，發(fā)酵至24 h，萃取發(fā)酵液，利用HPLC檢測(cè)PCN產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。首先是luxR_19的回補(bǔ)：HT66CL/pME-luxR在24 h PCN產(chǎn)量為475.3 mg/L，與HT66CL的153.4 mg/L相比有明顯回升；較HT66的405.2 mg/L略高，說(shuō)明通過(guò)luxR_19基因的回補(bǔ)，其產(chǎn)吩嗪能力回復(fù)到野生型；同時(shí)，HT66CL/pME-luxR的吩嗪產(chǎn)量明顯高于HT66/pME的203.5 mg/L，是HT66/pME的2倍；一般來(lái)說(shuō)，由于pME6032質(zhì)粒較大，可能對(duì)菌株的生長(zhǎng)帶來(lái)一定影響，HT66CL/pME的PCN產(chǎn)量最低，僅有103.5 mg/L。然后是luxR_19基因的過(guò)表達(dá)，HT66/pME-luxR的PCN產(chǎn)量達(dá)到了623.7 mg/L，較HT66提高了約50%，較HT66/pME提高了2倍。

2.5 利用qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平

根據(jù)之前研究和文獻(xiàn)報(bào)道，選取了參與吩嗪合成和調(diào)控吩嗪合成的重要基因，包括雙元調(diào)控基因gacS/gacA，全局性調(diào)控基因rpeA、psrA、rsmE、rpoS，群體感應(yīng)調(diào)控基因phzI/phzR，吩嗪合成必需基因phzE等進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，以研究luxR_19基因的敲除對(duì)其產(chǎn)生的影響。以HT66野生型為參照對(duì)象，基因表達(dá)量的變化如表4所示。

表4 HT66菌株及其基因敲除株中基因表達(dá)量變化

表4顯示，在HT66CL菌株中，直接參與吩嗪合成的基因phzI/phzR以及phzE基因，其表達(dá)水平都有一定的降低，其中phzI為野生型的0.822，phzR為野生型的0.739，phzE的表達(dá)量較phzI與phzR而言下降的較少，為野生型的0.901倍。這一結(jié)果與發(fā)酵結(jié)果，即PCN產(chǎn)量有一定下降所一致，從分子層面給上驗(yàn)證了luxR_19基因的敲除會(huì)導(dǎo)致吩嗪合成的降低。

從相關(guān)調(diào)控基因而言，HT66CL菌株的gacA的表達(dá)量顯著降低，僅為野生型的0.593倍；而gacS的表達(dá)量基本維持在穩(wěn)定的水平，為野生型的1.170倍。rpeA的表達(dá)量顯著升高，為野生型的1.894倍，根據(jù)目前報(bào)道，rpeA能夠在一定程度上抑制吩嗪類產(chǎn)物的合成［13］，與本結(jié)果一致。對(duì)于兩個(gè)sigma因子而言，rpoS的表達(dá)量保持穩(wěn)定，rpoD有一定的下降，均與本研究的發(fā)酵結(jié)果一致。luxR_19基因的敲除導(dǎo)致rsmE與psrA基因表達(dá)量下降，分別為野生型的0.367與0.759，但根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，這兩個(gè)基因均屬于負(fù)調(diào)控基因。結(jié)果表明luxR_19能夠影響多個(gè)基因的表達(dá)，應(yīng)屬于全局性調(diào)控基因。

3 討論

根際促生菌株P(guān). chlororaphis HT66是一株高產(chǎn)PCN的菌株，以HT66作為出發(fā)菌株，通過(guò)前期的菌種誘變，我們得到了PCN高產(chǎn)菌株P(guān)3，基于對(duì)突變株的全基因組比較分析，發(fā)現(xiàn)luxR_19發(fā)生了點(diǎn)突變。通過(guò)基因序列的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)luxR_19在假單胞菌中具有較高同源性，進(jìn)一步分析氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)第85位氨基酸序列附近的氨基酸序列高度保守，處于luxR_19的活性區(qū)域。于是我們通過(guò)一系列的分子操作研究了luxR_19基因?qū)ζ渖L(zhǎng)及吩嗪產(chǎn)量方面的影響。同時(shí)，利用點(diǎn)突變株HT66PM驗(yàn)證第85位氨基酸的改變對(duì)吩嗪產(chǎn)量的可能影響。

由于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成在很大程度上會(huì)受到菌株生長(zhǎng)情況的影響，LuxR家族調(diào)控因子對(duì)于菌體生長(zhǎng)的調(diào)控是多方面的，如通過(guò)控制群體感應(yīng)，調(diào)節(jié)生物的從動(dòng)能力以增加生物的環(huán)境適應(yīng)性，如ppoR，通過(guò)調(diào)控相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成以增加其環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)力等［14］。因此在將luxR_19基因敲除后，我們首先對(duì)其進(jìn)行了生理生化能力的檢測(cè)，包括測(cè)定生長(zhǎng)曲線，菌體泳動(dòng)性以及群體從動(dòng)性3個(gè)指標(biāo)。結(jié)果表明luxR_19基因的敲除不影響菌體的生長(zhǎng)狀況，但是會(huì)在一定程度上影響其群體從動(dòng)性。在后期的工作中，可以嘗試通過(guò)對(duì)該基因進(jìn)行突變，從而達(dá)到增加群體從動(dòng)性，確保菌株能夠在自然環(huán)境中更有競(jìng)爭(zhēng)力地定植于植物根部，從而促進(jìn)合成PCN，更好地進(jìn)行根際促生作用。

luxR_19基因敲除后，PCN產(chǎn)量有一定下降，在對(duì)其進(jìn)行回補(bǔ)后，產(chǎn)量回到了正常水平，將該基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)后，產(chǎn)量較野生菌株有很大的提升。說(shuō)明該基因確實(shí)對(duì)PCN的產(chǎn)量有一定影響，且對(duì)于PCN的合成起正調(diào)控作用。通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)了與PCN合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)luxR_19基因的缺失直接導(dǎo)致gacA基因表達(dá)量明顯降低，rpeA負(fù)調(diào)控因子表達(dá)量上升，并在一定程度上導(dǎo)致phz基因簇的表達(dá)情況。據(jù)此推測(cè)luxR_19對(duì)于PCN合成的調(diào)控作用可能是通過(guò)Gac系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行的，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

通過(guò)點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的點(diǎn)突變與P3菌株的高產(chǎn)無(wú)直接聯(lián)系，也說(shuō)明化學(xué)誘變株高產(chǎn)原因的復(fù)雜性。但無(wú)論是通過(guò)本實(shí)驗(yàn)或是相關(guān)報(bào)道，我們都能發(fā)現(xiàn)LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子確實(shí)都參與到次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控中。后期工作將繼續(xù)分析鑒定P3菌株高產(chǎn)的影響位點(diǎn)，闡明P3菌株高產(chǎn)PCN的機(jī)制。

雖然HT66/pME-luxR較HT66而言，吩嗪產(chǎn)量?jī)H僅提高了50%，但我們認(rèn)為這是由于實(shí)驗(yàn)所選用的載體pME6032質(zhì)粒較大，其本身會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)帶來(lái)一定影響。對(duì)比HT66/pME-luxR與HT66/pME兩株菌的吩嗪產(chǎn)量，可以發(fā)現(xiàn)前者是后者的兩倍，這足以展現(xiàn)luxR_19這一基因在提升吩嗪產(chǎn)量上的潛在能力。

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們可以通過(guò)以下兩個(gè)方面來(lái)提升luxR_19在促進(jìn)吩嗪生成方面的作用：選用拷貝數(shù)更加高的載體，減小對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響；對(duì)該基因作逐步的片段分析，發(fā)現(xiàn)其作用位點(diǎn)，從而直接在基因組上進(jìn)行修飾，解除對(duì)載體的依賴，構(gòu)建吩嗪高產(chǎn)菌株。同時(shí)，我們將對(duì)誘變株的高產(chǎn)原因作繼續(xù)研究，揭示其高產(chǎn)機(jī)理。

4 結(jié)論

在Pseudomonas chlororaphis HT66菌株中：luxR_ 19對(duì)PCN的合成是正調(diào)控因子；luxR_19對(duì)細(xì)菌從動(dòng)性有一定影響，而對(duì)菌體生長(zhǎng)及泳動(dòng)性無(wú)較大影響；誘變高產(chǎn)株P(guān)3的PCN產(chǎn)量提高不是由于luxR_19的堿基點(diǎn)突變?cè)斐伞?/p>

［1］張鋒華， 許煜泉， 張雪洪.農(nóng)用殺菌劑吩嗪-1-羧酸的生物合成與基因調(diào)控［J］.農(nóng)藥研究與應(yīng)用， 2006（5）：4-7.

［2］張?jiān)疲?胡洪波， 彭華松， 等.產(chǎn)PCA基因工程菌M18G反復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究［J］.工業(yè)微生物， 2007：16-20.

［3］Han SH， Lee SJ， Moon JH， et al. GacS-dependent production of 2R， 3R-butanediol by Pseudomonas chlororaphis O6 is a major determ inant for eliciting systemic resistance against Erwinia carotovora but not against Pseudomonas syringae pv. tabaci in tobacco［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 2006， 19（8）：924-930.

［4］Chin-A-Woeng TF， Bloemberg GV， van der Bij AJ， et al. Biocontrol by phenazine-1-carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391 of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 1998， 11（11）：1069-1077.

［5］Liu H， He Y， Jiang H， et al. Characterization of a phenazineproducing strain Pseudomonas chlororaphis GP72 with broadspectrum antifungal activity from green pepper rhizosphere［J］. Curr Microbiol， 2007， 54（4）：302-306.

［6］Shen X， Hu H， Peng H， et al. Comparative genomic analysis of four representative plant growth-promoting rhizobacteria in Pseudomonas［J］. BMC Genomics， 2013， 14（1）：271.

［7］Loper JE， Hassan KA， Mavrodi DV， et al. Comparative genomics of plant-associated Pseudomonas spp.：insights into diversity and inheritance of traits involved in multitrophic interactions［J］. PLoS Genet， 2012， 8（7）：e1002784.

［8］Park J， Oh S， Anderson A， et al. Production of the antifungal compounds phenazine and pyrrolnitrin from Pseudomonas chlororaphis O6 is differentially regulated by glucose［J］. Lett Appl Microbiol， 2011， 52（5）：532-537.

［9］Maddula V， Pierson E， Pierson L. Altering the ratio of phenazines in Pseudomonas chlororaphis（aureofaciens）strain 30-84：effects on biofilm formation and pathogen inhibition［J］. J Bacteriol， 2008，190（8）：2759-2766.

［10］Huang L， Chen MM， Wang W， et al. Enhanced production of 2-hydroxyphenazine in Pseudomonas chlororaphis GP72［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2011， 89（1）：169-177.

［11］張平原， 彭華松， 張雪洪.高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的綠針假單胞菌的誘變與基因工程育種［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版， 2015， 33（2）：90-94.

［12］He W， Lei J， Jiu Y， et al. The LuxR family members gdmri and gdm rii are positive regulators of geldanamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus 17997［J］. Arch Microbiol， 2008，189（5）：501-510.

［13］Whistler CA， Pierson III LS. Repression of phenazine antibiotic p roduction in Pseudomonas aureofaciens strain 30-84 by RpeA［J］. J Bacteriol， 2003， 185（13）：3718-3725.

［14］Fernández-pi?ar R， Cámara M， Soriano MI， et al. Ppor， an orphan luxr-family protein of Pseudomonas putida KT2440，modulates competitive fitness and surface motility independently of n-acylhomoserine lactones［J］. Environmental Microbiology Reports， 2011， 3（1）：79-85.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Effects of luxR_19 on the Synthesis of Phenzaine-1-carboxam ide in Pseudomonas chlororaphis HT66

Chen Yawen Peng Huasong Wang Wei Zhang Xuehong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200240）

In order to study the potential effects of regulator gene luxR_19 on the synthesis of antibacterial substance phenazine-1-carboxamide（PCN）and physiological-biochemical characteristics in Pseudomonas chlororaphis HT66， strains of gene luxR_19-knockout，-complementation， -overexpression and -point-mutation were constructed， and then the growth curve， fermentation production of PCN， swimming and swarming activities were tested at the target strains. The results showed that the knockout of luxR_19 lowered the production of PCN and the over-expression of gene luxR_19 increased the double production of PCN compared to the wild type；luxR_19 gene affected the expression of several genes relating to the regulation or synthesis of phenazines. Besides， the knockout of luxR_19 had no effects on the growth and swimming activity， however， promoted the swarming activity of HT66. The production of PCN in point-mutation strain of luxR_19（G85A）was similar to that in wild type. The above results indicated that luxR_19 was the positive regulator of PCN production， and could affect the swarming activity of HT66. Besides， the point-mutation at 254thsite in luxR_19 did not affect the production of PCN.

Pseudomonas chlororaphis；HT66；phenazine-1-carboxamide；transcriptional regulator of LuxR family

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.024

2014-12-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270084），國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022107）

陳亞汶，女，碩士研究生，研究方向：微生物代謝調(diào)控；E-mail：moda_yaya@hotmail.com

張雪洪，男，博士，教授，研究方向：微生物代謝調(diào)控；E-mail：xuehzhang@sjtu.edu.cn