海洋真菌提取物損傷大腸桿菌DNA活性的篩選及活性菌株研究

鮑海燕谷朋娟張翼穆軍馮妍趙辰燕

（1.大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，大連　116028；2.廣東海洋大學(xué)食品與科技學(xué)院　廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江　524088；3.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，舟山　316022）

海洋真菌提取物損傷大腸桿菌DNA活性的篩選及活性菌株研究

鮑海燕1谷朋娟1張翼2穆軍3馮妍2趙辰燕1

（1.大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，大連116028；2.廣東海洋大學(xué)食品與科技學(xué)院廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江524088；3.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，舟山316022）

從海洋微生物中篩選抗菌、抗腫瘤物質(zhì)是海洋藥物研究的熱點(diǎn)之一，而篩選模型在研究中起著重要作用。建立了可用于抗菌及潛在抗腫瘤活性物質(zhì)篩選的大腸桿菌差異性DNA修復(fù)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并運(yùn)用該模型對(duì)海洋共附生真菌的提取物進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，5株海洋真菌的提取物具有較強(qiáng)的選擇性抑制DNA損傷修復(fù)基因缺陷型大腸桿菌的活性，可能具有DNA損傷作用。對(duì)這5種活性真菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，而且薄層色譜（TLC）和高效液相色譜（HPLC）-活性追蹤顯示這些菌株可產(chǎn)生較多樣化的活性物質(zhì)。

海洋微生物；大腸桿菌差異性DNA修復(fù)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?；鑒定

海洋微生物藥物是海洋藥物與生物技術(shù)重要的交叉領(lǐng)域，海洋真菌作為海洋微生物的重要組成類群，具有生物活性代謝產(chǎn)物豐富且相對(duì)易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，從海洋真菌中篩選生物活性物質(zhì)已成為海洋藥物研究的熱點(diǎn)，據(jù)不完全檢索，僅天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（Dictionary of Natural Products 2011）中收錄的海洋真菌抗菌與抗腫瘤活性化合物就已達(dá)87個(gè)［1］，新的報(bào)道仍不斷涌現(xiàn)［2，3］。

眾所周知，高效、靈敏、可靠的藥物篩選模型對(duì)藥物發(fā)現(xiàn)非常關(guān)鍵。就抗腫瘤藥物篩選而言，最常用的細(xì)胞毒體外篩選模型也存在一些局限性，如對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求和運(yùn)行成本都比較高，不太適合大量粗提物樣品的經(jīng)濟(jì)快速篩選。而從藥物作用機(jī)理來(lái)看，很多抗腫瘤或抗菌藥物的作用機(jī)制主要是作用于DNA，而多數(shù)對(duì)DNA 有損傷的物質(zhì)雖有一定毒性但也有抗腫瘤或抗菌作用，其中毒副作用小的可望用做臨床藥物［4］。大腸桿菌（Escherichia coli）差異性DNA損傷修復(fù)試驗(yàn)（Differentiated DNA damage repair test，DDRT）是一種用于檢測(cè)物質(zhì)對(duì)DNA損傷能力的試驗(yàn)方法，它以一對(duì)大腸桿菌菌株（其中一個(gè)具有正常的DNA損傷修復(fù)能力，而另外一個(gè)存在相應(yīng)的基因缺陷）經(jīng)樣品處理后生長(zhǎng)受抑制程度的差異來(lái)判斷樣品是否具有損傷DNA的作用，該方法被用于環(huán)境毒物遺傳毒性評(píng)價(jià)，也被用于抗菌與潛在抗腫瘤物質(zhì)活性篩選，該方法用于篩選抗腫瘤藥物，簡(jiǎn)單快速，與腫瘤細(xì)胞株模型的結(jié)果具有一定的相關(guān)性［5-7］，還可兼顧抗菌活性，且適合于大量粗提物樣品的快速經(jīng)濟(jì)篩選。本研究建立該方法并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的分離自大連潮間帶海洋生物的共附生真菌［8，9］發(fā)酵提取物進(jìn)行活性篩選與相關(guān)研究，旨在為從海洋微生物中篩選抗菌抗腫瘤物質(zhì)用于海洋藥物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供篩選菌株：本實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋真菌66株；指示菌株：來(lái)自耶魯大學(xué)菌種庫(kù)，包括野生型大腸桿菌和缺陷性大腸桿菌兩種，編號(hào)分別為AB1157（+）、AB3027（-）。

1.1.2 培養(yǎng)基 海洋真菌培養(yǎng)基（1 L）：蔗糖20 g、馬鈴薯汁500 mL、4%的人工海水500 mL、pH自然。如需固體培養(yǎng)基，則加入1.5%-2%的瓊脂粉。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂粉15 g、純水1 000 mL、pH自然。均高壓蒸汽滅菌。

1.2方法

1.2.1 指示菌懸液的制備 指示菌E. coli AB1157（+）和AB3027（-）的斜面經(jīng)37℃兩次活化培養(yǎng)后，在超凈臺(tái)中加入少量無(wú)菌生理鹽水洗滌菌落搖勻，分別倒入無(wú)菌試管，并均稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋∣D600= 0.136）。

1.2.2 大腸桿菌差異性DNA損傷修復(fù)模型的驗(yàn)證 采用平皿濾紙片法檢測(cè)博萊霉素、絲裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、氨芐青霉素、紫杉醇6種藥物各自對(duì)這兩株大腸桿菌指示菌的抑制差異性。

將100 μL指示菌［AB1157（+）或AB3027（-）］懸液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，靜置待表面稍干，用鑷子貼上滴加有5 μg和2 μg藥物（溶劑為25 μL純水或甲醇）并晾干的無(wú)菌濾紙片，每個(gè)指示菌種、每種藥物、每個(gè)劑量做3個(gè)平行，以滴加25 L甲醇并晾干的濾紙片為陰性對(duì)照。每個(gè)平皿均勻貼7片濾紙片，背面做好標(biāo)記。將平皿于4℃倒置擴(kuò)散過(guò)夜后，取出于37℃倒置培養(yǎng)12-16 h，取出、測(cè)量記錄抑菌圈直徑，并用抑菌圈直徑數(shù)據(jù)計(jì)算藥物對(duì)這兩株指示菌的抑菌圈直徑比［AB3027（-）/AB1157（+）］以及該比值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并采用t檢驗(yàn)分析其比值與1之間的差異顯著性（n=9）。

1.2.3 海洋真菌的發(fā)酵與提取 將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d活化的待篩菌種，接種到每個(gè)含100 mL海洋真菌液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，無(wú)菌透氣膜封口后28℃靜置培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)結(jié)束后，加入少量乙酸乙酯過(guò)夜殺菌，抽濾分離菌絲體與發(fā)酵液。菌絲體用100 mL甲醇浸泡過(guò)夜后抽濾，得濾液；發(fā)酵液用1/2體積乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層；將菌絲體提取物與發(fā)酵液提取物合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃濃縮至干，用少量甲醇∶二氯甲烷（1∶1）多次溶解洗滌后轉(zhuǎn)入樣品瓶，定容至3 mL，冷藏備用。

1.2.4 活性物質(zhì)的篩選

1.2.4.1 初篩 將每種樣品一個(gè)濾紙片（滴加25 μL提取物）晾干后貼到涂有100 μL指示菌AB3027（-）的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，使用模型驗(yàn)證相同的方法培養(yǎng)，并觀察、測(cè)量抑菌圈直徑。對(duì)于抑菌圈較明顯（抑菌圈大于8 mm）的樣品，使用同樣的方法重復(fù)篩選1次（二次初篩）。

1.2.4.2 復(fù)篩 將初篩得到的樣品用兩種指示菌缺陷型AB3027（-）和野生型AB1157（+）共同實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行復(fù)篩。配制兩種指示菌的新鮮菌懸液，每種指示菌、每個(gè)樣品做3個(gè)平行。在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12-16 h后取出，測(cè)量記錄不同樣品分別對(duì)兩種指示菌抑菌圈的直徑，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選出具有強(qiáng)DNA損傷活性的樣品。

1.2.5 強(qiáng)活性菌株的分子生物學(xué)鑒定及薄層層析指紋圖譜

1.2.5.1 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳以及測(cè)序［8］。測(cè)序引物為真菌通用引物ITS1和ITS4，將測(cè)序得到的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS rDNA）全序列提交GenBank進(jìn)行BLAST檢索，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行相似性比較。并用Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)后，采用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化鄰接樹(shù)［10］。

1.2.5.2 薄層層析（TLC） 用毛細(xì)管吸取活性樣品各約5 μL點(diǎn)樣于GF254硅膠薄層層析板，置層析缸中以二氯甲烷∶甲醇（V/V=20∶1）為展開(kāi)劑展開(kāi)后取出晾干，置于254 nm及365 nm的紫外燈下觀察并拍攝圖像，再噴茴香醛-硫酸顯色劑后加熱顯色，用掃描儀記錄圖像。

1.2.6 強(qiáng)活性樣品的高效液相色譜-活性追蹤

1.2.6.1 液相分離與96孔板收集 活性樣品經(jīng)3 000 r/min、20 min離心后，分別取20 μL進(jìn)行依利特P230型高效液相色譜分析，色譜柱為4.6×250 mm，5 μm粒徑Hypersil填料的C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水系統(tǒng)（梯度洗脫），流速0.6 mL/min，將96孔板置于檢測(cè)器后的流出口，從第3孔起每30 s一孔依次收集流分直至46.5 min（第96孔）。收集完畢后，每孔用甲醇補(bǔ)滿，用多道移液槍移1/2到另一個(gè)空96孔板中，一一對(duì)應(yīng)，即一個(gè)樣品對(duì)應(yīng)兩個(gè)96孔板（分別用于培養(yǎng)兩株大腸桿菌指示菌）做好標(biāo)記。將96孔板置于超凈臺(tái)中，用無(wú)菌風(fēng)吹至近干，再置于潔凈的真空干燥箱中徹底干燥。

1.2.6.2 指示菌孵育與DNA損傷活性追蹤 先將96孔板表面及邊緣用酒精棉擦拭后，揭開(kāi)蓋子置于超凈臺(tái)紫外殺菌20 min。其后在每塊96孔板的A行第1孔加180 μL培養(yǎng)基和20 μL的生理鹽水（空白），第2孔加入180 μL的培養(yǎng)基和20 μL的菌懸液（對(duì)照），其余各孔均加入180 μL的培養(yǎng)基和20 μL的菌懸液，小心的水平晃動(dòng)混勻。每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的兩塊96孔板中，一個(gè)加AB1157（+）的菌懸液，另一個(gè)加AB3027（-）的菌懸液。將96孔板于37℃培養(yǎng)16-18 h后，在各孔中加入25 μL的MTT顯色劑（2 mg/mL），于37℃再培養(yǎng)30 min，拍照，并用酶標(biāo)儀測(cè)540 nm波長(zhǎng)下各孔光吸收值（A）。

1.2.6.3 數(shù)據(jù)處理與作圖 使用Excel軟件，根據(jù)公式［抑菌率（IR）= 100%×（A對(duì)照-A樣品）/（A對(duì)照-A空白）］計(jì)算各孔抑菌率，然后計(jì)算每個(gè)樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（ti）的對(duì)兩種指示菌的抑菌率差值，即抑菌率差值=IRti，AB3027（-）-IRti，AB1157（+），作抑菌率差值-時(shí)間折線圖，此即樣品的選擇性抗大腸桿菌［AB3029（-）與AB1157（+）］活性色譜圖。通過(guò)活性色譜圖與HPLC譜圖的對(duì)照，可指認(rèn)樣品中的活性峰。

2 結(jié)果

2.1 篩選模型的驗(yàn)證

圖1 五種抗菌或抗腫瘤藥物對(duì)兩種指示菌的抑菌圈直徑之比

理論上講，如果某藥物對(duì)這一對(duì)指示菌存在無(wú)差別的抑制活性，則抑菌圈直徑比值應(yīng)等于1。如圖1所示，博萊霉素、絲裂霉素C、阿霉素和5-氟尿嘧啶這4種抗腫瘤藥物對(duì)這兩株指示菌［AB3027（-）/AB1157（+）］的抑菌圈直徑比值均大于1，且t值均大于t0.05（2.306），說(shuō)明其對(duì)兩種指示菌抑菌圈的比值與“1”之間都存在顯著差異，其中以博萊霉素（2 μg）、絲裂霉素（5 μg、2 μg）和阿霉素（5 μg、2 μg）最為顯著，其t值均大于甚至遠(yuǎn)大于t0.01（3.355）（如絲裂霉素2 μg對(duì)應(yīng)的t值為12.38），說(shuō)明它們都顯示出了預(yù)期的DDRT差異活性（即對(duì)缺陷型菌株的抑制強(qiáng)于對(duì)野生型的抑制）。而氨芐青霉素在2 μg時(shí)t=3.75略大于t0.01，可認(rèn)為與“1”之間具有顯著差異，但差異不算太大，說(shuō)明在該劑量下對(duì)兩種指示菌活性差別較?。欢? μg劑量下t=18.09，遠(yuǎn)大于t0.01，說(shuō)明存在較顯著差異，其具體機(jī)制有待研究。另外，篩選中也發(fā)現(xiàn)紫杉醇對(duì)兩種指示菌均無(wú)抑制活性（即無(wú)抑菌圈）。

2.2 活性物質(zhì)篩選結(jié)果

2.2.1 初篩結(jié)果 考慮到樣品數(shù)量較多，先用指示菌AB3027（-）進(jìn)行了初篩，從66株海洋真菌的提取物中發(fā)現(xiàn)了48株樣品具有清晰的抑菌圈。在這些活性樣品中有14個(gè)樣品抑菌圈直徑大于8 mm，如表1所示。

表1 紙片擴(kuò)散法初篩中顯示相對(duì)較強(qiáng)抑制E. coli AB3027（-）活性的樣品

2.2.2 復(fù)篩的結(jié)果 為考察這些活性樣品是否具有DNA損傷活性，從上述初篩結(jié)果中選取抑菌圈不小于10 mm的11個(gè)樣品，進(jìn)行了同時(shí)拮抗兩株指示菌的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表2）表明，有5株真菌的提取物樣品即6-N、6-F、DLEN2008006、15-F和DLEN2008024，表現(xiàn)出明顯的選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性，可用于進(jìn)一步的菌種鑒定及提取物成分研究。

表2 同時(shí)使用E. coli AB1157（+）和AB3027（-）作為指示菌的紙片擴(kuò)散法復(fù)篩結(jié)果

2.3 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定及TLC指紋圖譜

表3 五個(gè)活性菌株的測(cè)序和比對(duì)結(jié)果

通過(guò)真菌通用引物PCR擴(kuò)增了該5株活性真菌的核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2 rDNA）序列，測(cè)得的序列用BLAST與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，顯示它們與已知種屬的相似度都達(dá)到了99%-100%（表3）；而且，其序列與GenBank中收錄的相同及相近種屬的同源序列一起構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），也顯示菌株DLEN2008006、6-F和15-F分別與曲霉屬的Aspergillus clavatus、A. sydowii和A. fumigatus親緣關(guān)系較近，菌株6-N和DLEN2008024則分別與糞殼菌綱的Chaetomium globosum 和Glomerella acutata有較近親緣關(guān)系。由此確定了這些菌株的種屬，它們都屬于子囊菌門中的盤菌亞門。

圖2 根據(jù)ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列構(gòu)建的5株活性真菌的系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)

而且，薄層層析（圖3）顯示，在同一培養(yǎng)條件下，這5個(gè)菌株的次生代謝產(chǎn)物也有較大的差異，同屬于曲霉屬的6-F、15-F和DLEN2008006的次生代謝指紋差別顯著。

圖3 五種活性樣品的薄層層析圖像（254、365 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)）

2.4 活性樣品的HPLC-活性跟蹤實(shí)驗(yàn)

通過(guò)HPLC-C18柱分離、96孔板收集及隨后對(duì)兩種指示菌的抑制活性測(cè)試與數(shù)據(jù)分析，可將各樣品的HPLC譜圖與其選擇性抑制大腸桿菌［AB3027（-）/AB1157（+）］活性色譜圖對(duì)應(yīng)起來(lái)。結(jié)果（圖4）顯示，該5個(gè)樣品的HPLC色譜圖呈現(xiàn)較大的差異，這與分類學(xué)及TLC分析結(jié)果是一致的；而且這5個(gè)樣品中的主要活性色譜峰也各不相同。

菌株6-N提取物中選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性主要集中在保留時(shí)間為8.75 min的顯著色譜峰，其對(duì)缺陷型菌株及野生型菌株的抑制率差值達(dá)到100%；6-F提取物中選擇性抑制缺陷型大腸桿菌的活性色譜峰的分布比較分散，有多個(gè)峰抑菌率差值介于50%-70%之間；DLEN2008006提取物中保留時(shí)間6.25 min的顯著色譜峰顯示了最強(qiáng)的選擇活性，其對(duì)缺陷型大腸桿菌與野生型菌株的抑制率差值達(dá)到100%；15-F提取物中保留時(shí)間為4.75 min和41.25 min的色譜峰顯示了相對(duì)較強(qiáng)的選擇活性，其抑制率差值均在70%左右；而菌株DLEN2008024提取物中的色譜峰選擇活性相對(duì)都比較弱，保留時(shí)間為5.25 min的色譜峰達(dá)到50%左右的抑菌率差值。

另外，上述樣品中都存在一些色譜峰具有“負(fù)”的選擇活性，即對(duì)缺陷型菌株及野生型菌株的抑制率差值為負(fù)值，特別是菌株6-F（保留時(shí)間2.75 min無(wú)紫外吸收的活性峰）和DLEN2008024（保留時(shí)間41.25 min的色譜峰）中都出現(xiàn)了抑菌率差值為-100%的色譜峰，這些色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)也可用于非DNA損傷機(jī)制抗菌藥物的研究。

圖4 五株活性真菌提取物的HPLC色譜圖（254 nm，A）和選擇性抗大腸桿菌［AB302F（-）/AB1157（+）］活性色譜圖（B）（箭頭標(biāo)明主要活性色譜峰）

3 討論

從海洋微生物中尋找抗腫瘤、抗菌活性物質(zhì)是海洋藥物研究的重要課題，而經(jīng)濟(jì)高效的篩選模型在研究工作中至關(guān)重要，一些采用特殊的微生物或其他低等生物作指示的方法常被用于對(duì)大量發(fā)酵粗提物的活性初篩，如大腸桿菌生化誘導(dǎo)分析（BIA）法、海蝦致死法、稻瘟霉法等［11-13］。大腸桿菌差異性DNA 損傷修復(fù)試驗(yàn)法（DDRT）用于篩選基于DNA損傷機(jī)制的抗腫瘤抗菌藥物，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)現(xiàn)在不同位點(diǎn)、經(jīng)各種途徑誘導(dǎo)遺傳損傷的樣品，且能兼顧抗菌與抗腫瘤活性，適合于需要大量微生物發(fā)酵粗提物樣品的篩選。大腸桿菌菌株對(duì)E. coli 343/591 和E. coli 343/636曾被引入國(guó)內(nèi)用于該方法［14］，本研究則采用了曾用于環(huán)境遺傳毒理研究的大腸桿菌菌株對(duì)E. coli AB3027（-）（DNA損傷修復(fù)基因缺陷型）和E. coli AB1157（+）（具有正常DNA損傷修復(fù)功能的野生型）來(lái)建立該模型［7］。

在該模型對(duì)DNA損傷活性物質(zhì)的響應(yīng)能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，博萊霉素、絲裂霉素C、阿霉素和5-氟尿嘧啶這4種抗腫瘤藥物都顯示出了預(yù)期的DDRT差異活性（即對(duì)缺陷型菌株的抑制強(qiáng)于對(duì)野生型的抑制），這可能與它們的作用機(jī)制均針對(duì)DNA有關(guān)［15-18］；而前人藥理學(xué)研究指出紫杉醇作用于微管，與DNA無(wú)關(guān)［19，20］，本研究也顯示它對(duì)這兩株指示菌均無(wú)抑制。這些結(jié)果表明由這對(duì)大腸桿菌菌株組成的DDRT模型確可用于檢測(cè)選擇性損傷DNA的物質(zhì)。當(dāng)然該模型也存在一定局限性，在具體應(yīng)用中最好能與腫瘤細(xì)胞株等模型結(jié)合使用，進(jìn)行分級(jí)篩選，但作為一個(gè)經(jīng)濟(jì)的初篩模型仍然具有自身的價(jià)值。

使用該篩選模型，本研究發(fā)現(xiàn)5株海洋真菌顯示出了較強(qiáng)的DDRT差異活性，很可能具有DNA損傷活性，它們均來(lái)自子囊菌門（Chaetomium、Aspergillus和Glomerella屬）。目前已經(jīng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制為損傷DNA的真菌天然產(chǎn)物并不多，檢索表明天然產(chǎn)物詞典（Dictionary of Natural Products on DVD）中收錄的真菌產(chǎn)生的直接或間接損傷DNA活性的化合物僅9例報(bào)道，主要來(lái)自子囊菌（Paecilomyces、Alternaria、Fusarium和 Oidiodendron屬）和擔(dān)子菌（Marasmius、Curvularia和Lactarius屬），化合物類型包括蒽醌或萘醌衍生物、二萜衍生物、生物堿以及含吡喃酮或呋喃酮結(jié)構(gòu)的化合物等［1］。而本研究發(fā)現(xiàn)的菌株不同于這些已經(jīng)報(bào)道的種屬，且系統(tǒng)發(fā)育分析及TLC、HPLC-活性跟蹤顯示它們具有生物學(xué)和化學(xué)的多樣性，因此從中發(fā)現(xiàn)新的DNA損傷活性物質(zhì)可能性較大。

值得注意的是，這些菌株中彌散分布、含量較低但仍顯示出中低選擇活性（對(duì)兩種指示菌的抑制率差值多數(shù)在40%-60%之間）的色譜峰多樣性也很高，這為尋找多樣性的DNA損傷活性物質(zhì)提供了啟示和深入研究的線索。其中有些活性峰可能是因?yàn)楹康?，使得差別顯現(xiàn)得還不夠充分，如果加大進(jìn)樣量，可能會(huì)更加凸顯。另外，也不排除其中有些是受到指示菌的生長(zhǎng)狀態(tài)不均衡、96孔板間移液操作不準(zhǔn)確等實(shí)驗(yàn)誤差的影響所造成的假陽(yáng)性，采取更多的實(shí)驗(yàn)重復(fù)可能會(huì)排除這種影響。

當(dāng)然，盡管對(duì)DNA損傷修復(fù)基因缺陷型大腸桿菌的選擇性抑制表明這些樣品可能作用于大腸桿菌的DNA，但其損傷效應(yīng)還有待彗星實(shí)驗(yàn)的直觀驗(yàn)證［21］，其抗腫瘤潛力及對(duì)高等動(dòng)物正常體細(xì)胞DNA是否具有損傷作用也有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究建立了一種基于缺陷型/野生型大腸桿菌菌株對(duì)的DNA損傷活性篩選模型，該模型對(duì)于絲裂霉素C、阿霉素等抗腫瘤藥物都有較好的響應(yīng)，可用于抗菌及潛在抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選，因其成本低廉、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)尤其適合海洋微生物等涉及大量粗提物的活性篩選。運(yùn)用該模型，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋真菌菌株進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了5株活性海洋真菌，鑒定了其種屬并對(duì)其TLC特征及活性成分進(jìn)行了追蹤分析，研究表明這些菌株具有較好的生物與化學(xué)多樣性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening the Extracts of M arine Fungi for the Activity of Damaging the DNA of Escherichia coli and Researches on Active Strains

Bao Hanyan1Gu Pengjuan1Zhang Yi2Mu Jun3Feng Yan2Zhao Chenyan1
（1.College of Environmental and Chemical Engineering，Dalian Jiaotong University，Dalian116028；2.College of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory for Processing and Safety of Aquatic Products，Key Laboratory of Further Processing Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang524088；3. College of Marine Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022）

Screening of antimicrobial and antitumor agents from marine microorganisms is one of the hot spots for the research of marine drugs， and screening models play an important role in the study. The authors set up an Escherichia coli differentiated DNA damage repair test model， which can be used for the screening of antimicrobial and potential antitumor substances. This model was further applied to screen the bioactivities of the extracts of marine symbiotic fungi. As the result， five marine fungal strains’ extracts showed strong selective inhibition to E. coli strains with DNA damage repairing genes-deficiency， i.e， the potential of damaging DNA. The five strains were identified by molecular biological methods. Furthermore， analyses by thin layer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography（HPLC）-bioactivity tracing revealed that these strains produced diverse bioactive substances.

marine microorganisms；Escherichia coli differentiated DNA damage repair test model；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.020

2014-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20902009），中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2011M500051，2012T50258），廣東省“揚(yáng)帆計(jì)劃”引進(jìn)緊缺拔尖人才項(xiàng)目（201433009），廣東海洋大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（E15155），廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目（GDOU2014030502，GDOU2014050203），廣東海洋大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（C14519）

鮑海燕，女，碩士研究生，研究方向：海洋真菌的生物活性，E-mail：baohaiyanbhy@163.com；谷朋娟同為本文第一作者

張翼，男，碩士生導(dǎo)師，研究方向：海洋藥用生物資源的研究與利用；E-mail：hubeizhangyi@163.com