大黃魚Wap65-2基因成熟肽區(qū)酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

裘天休李長紅陳炯

（1.　寧波大學科技學院，寧波　315211；2.　寧波大學海洋學院　生物化學與分子生物學實驗室，寧波　315211）

大黃魚Wap65-2基因成熟肽區(qū)酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

裘天休1，2李長紅2陳炯2

（1.寧波大學科技學院，寧波315211；2.寧波大學海洋學院生物化學與分子生物學實驗室，寧波315211）

用大黃魚Wap65-2基因成熟肽區(qū)構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并對誘餌質(zhì)粒進行自激活活性及毒性檢測。從大黃魚（Larimichthys crocea）肝組織cDNA中擴增Wap65-2基因成熟肽片段（LcWap65-2m），將其克隆至pGBKT7載體中，獲得誘餌載體pGBKT7-LcWap65-2m，經(jīng)PCR、酶切和測序驗證無誤后，轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187中，在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中觀察重組蛋白的毒性作用和自激活活性，同時利用Western blot分析重組蛋白的表達。成功擴增LcWap65-2m，并克隆至pGBKT7載體中；Western blot檢測結(jié)果表明，pGBKT7-LcWap65-2m在酵母細胞中表達誘餌蛋白LcWap65-2m；表型篩選結(jié)果顯示，LcWap65-2m無毒性作用和自激活活性。成功構(gòu)建了LcWap65-2m酵母雙雜交誘餌載體，為進一步利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與Wap65-2相互作用的蛋白奠定基礎(chǔ)。

Wap65-2；酵母雙雜交；表達；自激活；毒性

Wap65（Warm temperature acclimation related 65 kDa protein）是在硬骨魚類中普遍存在的一種重要蛋白質(zhì)，在魚類生命活動中起著重要的作用。最初通過雙向電泳技術(shù)在高溫馴化的鯽魚（Carassius auratus）和鯉魚（Cyprinus carpio）肌肉中檢測到Wap65的存在［1，2］。此后，通過表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）測序、cDNA文庫構(gòu)建和同源克隆等分子生物學技術(shù)，在數(shù)種魚類中發(fā)現(xiàn)Wap65存有Wap65-1和Wap65-2兩個亞型，包括紅鰭東方豚（Takifugu rubripes）［3］、青鳉（Oryzias latipes）［4，5］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、大鱗泥鰍（Misgurnus mizolepis）［7］、香魚（Plecoglossus altivelis）［8，9］和牙鲆（Paralchthys olivaceus）［10］。氨基酸序列多重比對分析顯示，魚類Wap65與哺乳動物血紅素結(jié)合蛋白（hemopexin，HPX）同源，具有與HPX相似的結(jié)構(gòu)特征，包括10個半胱氨酸殘基（Cys），可形成5個二硫鍵，用于維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以及結(jié)合血紅素所必需的7個芳香簇氨基酸殘基和2個組氨酸殘基［7-9］?；蚪M結(jié)構(gòu)分析也表明，魚類Wap65的基因組DNA結(jié)構(gòu)（從起始密碼子開始至終止密碼子結(jié)束）與人HPX結(jié)構(gòu)一致，均由9個內(nèi)含子和10個外顯子組成［3，5，6，9，10］。

Wap65-2是Wap65的一個亞型。近年來，越來越多的研究揭示，Wap65-2是一個多功能蛋白，不僅參與魚類的溫度適應(yīng)［6，11］，還與免疫應(yīng)答［6，12-13］、發(fā)育［5］、缺氧脅迫［10］和重金屬脅迫［14］等多種生理過程密切相關(guān)。在養(yǎng)殖魚類感染病原的研究中，Wap65-2基因mRNA和蛋白均被誘導表達［12，13］。例如，香魚感染鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）后，肝組織Wap65-2 mRNA表達上調(diào)高達12.0倍，血清Wap65-2蛋白表達量也顯著上調(diào)［12］；花鱸（Lateolabrax japonicus）感染哈維氏弧菌（Vibrio Harveyi）后，肝組織Wap65-2 mRNA表達量上調(diào)6.89倍，血清中Wap65-2蛋白表達量上調(diào)5.33倍［13］。上述研究揭示，Wap65-2參與細菌感染魚類引起的免疫反應(yīng)，但具體作用機制未知。Shi［15］構(gòu)建了香魚肝組織的酵母雙雜交cDNA文庫，采用庫庫篩選技術(shù)（library to library screening method，LLS），發(fā)現(xiàn)香魚Wap65-2能與補體系統(tǒng)的核心成份C3相互作用，揭示W(wǎng)ap65-2可能與魚類補體激活有關(guān)。因此，用大黃魚Wap65-2作為誘餌釣取其相互作用蛋白成為可能。

本研究擬構(gòu)建大黃魚（Larimichthys crocea）Wap65-2成熟肽區(qū)基因（LcWap65-2m）酵母雙雜交誘餌表達載體，檢測其在Y187酵母菌中是否具有毒性和自激活作用。研究結(jié)果將為利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與Wap65-2相互作用蛋白奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)相關(guān)的抗病育種及病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1菌株、質(zhì)粒pGBKT7由本實驗室保存。pMD19-T Simple Vector、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Nde I、Bam H I等購自TaKaRa公司（日本）。Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司（美國）。SDS-PAGE分子量蛋白標準購自Fermentas（ MBI）公司（美國）。酸洗玻璃珠（425-600 μm）購自Sigma公司（法國）。大黃魚Wap65-2特異性抗體由本實驗室保存。二抗（辣根酶標記山羊抗小鼠IgG）購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司（北京）。ECL化學發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒和柯達X-OMAT BT膠片等購自碧云天生物技術(shù)研究所（北京）。引物合成及序列測序工作由英維捷基貿(mào)易有限公司合成（上海）完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增LcWap65-2m cDNA序列 從健康大黃魚肝組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得LcWap65-2 cDNA序列，隨后通過特異性引物擴增、測序驗證，確定所獲得的序列與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（KJ412463）。根據(jù)LcWap65-2的成熟肽設(shè)計擴增引物，pYTHLcWap65-2F：5'-C CATATGCATGGCGACGCAGGACAT-3'和pYTH-LcWap65-2R：5'-C GGATCCCTAATCCTGACATGACAAC-3'（下劃線分別為Nde I和Bam H I酶切位點，斜體字母為保護堿基），以大黃魚肝組織cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL：肝組織cDNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），LA Taq 0.25 μL，10×LA buffer 2.5 μL，dNTP 4.0 μL，ddH2O 15.75 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，預(yù)期大小的擴增條帶經(jīng)回收純化后克隆至pMD19-T simple載體，重組質(zhì)粒采用ABI3730測序儀進行測序。將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-LcWap65-2m。

1.2.2 構(gòu)建及鑒定誘餌重組質(zhì)粒 采用Nde I和Bam H I 將質(zhì)粒pMD19-LcWap65-2m和 pGBKT7雙酶切，酶切后將目的基因片段及載體片段切膠回收。將載體片段與目的基因片段利用T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化TG1 感受態(tài)宿主菌，涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過夜。從平板中隨機挑選6個單菌落，分別接種于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒，PCR 初步驗證后，用Nde I和Bam H I雙酶切鑒定陽性克隆，并將陽性克隆送公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-LcWap65-2m。

1.2.3 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母 從-70℃冰箱取出Y187酵母菌株，劃線于YPDA平板，30℃培養(yǎng)直至菌落直徑2-3 mm。挑取單菌落至1 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，振蕩將菌塊打散，30℃ 250 r/min培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物全部接種于50 mL新鮮的YPDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。將全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至離心管中，室溫5 000 r/min 離心5 min，棄上清，50 mL 無菌水重懸菌體，再次離心，棄上清，菌體用1×TE/LiAc溶液（50 μL 1 mol/L LiAc，50 μL 10×TE buffer，400 μL無菌水）重懸浮，即為感受態(tài)細胞。向感受態(tài)細胞中加入0.1 μg質(zhì)粒，鮭精DNA 10 μL（0.1 mg），混勻后加入600 μL PEG/LiAc溶液（60 μL 1 mol/L LiAc，60 μL 10×TE buffer，480 μL PEG 3350），高速振蕩10 s，將混合物于30℃ 200 r/min培養(yǎng)30 min，加入70 μL二甲基亞砜（DMSO），42℃處理15 min，冰浴2 min，室溫14 000 r/min離心5 s，棄上清，菌體用500 μL 1×TE buffer重懸后涂布SD/-Trp平板，培養(yǎng)3-4 d。挑取單菌落，采用菌落PCR法驗證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功。

1.2.4 Western blot檢測誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達 挑取平板上新鮮培養(yǎng)直徑約1-2 mm的pGBKT7-LcWap65-2m/Y187酵母單菌落至5 mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)移到50 mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600為 0.4-0.6。4℃ 8 000 r/min離心5 min收集菌體，將菌體沉淀重懸于50 mL預(yù)冷的無菌去離子水中，再次離心，棄上清。向菌體加入100 μL 60℃預(yù)熱的裂解液（5 mol/L尿素，5% SDS，40 mmol/L Tris·Cl（pH6.8），0.1 mmol/L EDTA，40 mg/mL 嗅酚藍，1% β-琉基乙醇）、1 μL 0.1 mol/L PMSF 和80 μL酸洗玻璃珠，劇烈振蕩1 min，70℃水浴10 min，劇烈振蕩1 min，然后離心 5 min，收集上清，煮沸5-10 min，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將上清樣品經(jīng)5%濃縮膠（100 V，1 h）和12%分離膠（120 V，2 h）電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進行Western雜交，ECL化學發(fā)光法檢測雜交印跡。將凝膠放置于等面積、甲醇活化的PVDF膜上，然后夾在濾紙中，濾紙上下各3層，濕轉(zhuǎn)法35 V電轉(zhuǎn)移3.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用10%脫脂奶粉的PBS-T 37℃封閉2 h，加入LcWap65-2抗體（一抗，5% BSA的PBS-T 1∶500稀釋）4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用PBS-T洗滌PVDF膜，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（二抗，PBS-T 1∶5 000稀釋），37℃孵育1.5 h，洗滌后加上ECL于暗室顯影、定影。掃描儀掃描蛋白條帶。

1.2.5 誘餌質(zhì)粒毒性檢測 挑取pGBKT7-LcWap65-2m/Y187單菌落（直徑2-3 mm）至50 mL SD/-Trp/Kan（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，30℃振蕩 250 r/min培養(yǎng)24 h后，檢測OD600，若OD600≥0.8，說明融合蛋白BD-LcWap65-2m對酵母無毒性作用，反之有毒性。

1.2.6 誘餌質(zhì)粒自激活檢測 將pGBKT7-LcWap65-2m/Y187菌懸液涂布于SD/-Trp/X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上，30℃培養(yǎng)3-5 d，觀察生長情況和顏色反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 LcWap65-2m的PCR擴增

以健康大黃魚肝cDNA為模板，以帶酶切位點的誘餌載體構(gòu)建引物擴增LcWap65-2m，結(jié)果獲得大小約1 240 bp左右的特異性條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LcWap65-2m鑒定

PCR和雙酶切驗證結(jié)果（圖2）表明，目的片段已插入pGBKT7載體中，將構(gòu)建成功的載體命名為pGBKT7-LcWap65-2m。測序結(jié)果也表明，目的片段已按正確的框架插入pGBKT7中，且未發(fā)現(xiàn)核苷酸缺失和突變現(xiàn)象。

圖1 LcWap65-2m基因的PCR擴增

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7-LcWap65-2m雙酶切及PCR鑒定

2.3 酵母轉(zhuǎn)化子誘餌質(zhì)粒PCR驗證

采用菌落PCR法對酵母轉(zhuǎn)化子誘餌質(zhì)粒進行PCR驗證，結(jié)果（圖3）顯示，6個酵母轉(zhuǎn)化子均能擴增出1 240 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期大小相符，表明pGBKT7-LcWap65-2m轉(zhuǎn)化Y187菌株成功。

圖3 酵母轉(zhuǎn)化子pGBKT7-LcW ap65-2m/Y187 PCR驗證

2.4 誘餌蛋白LcWap65-2m在酵母中的表達

挑取Y187以及轉(zhuǎn)有誘餌載體pGBKT7-LcWap-65-2m的Y187單菌落擴大培養(yǎng)后，提取酵母總蛋白，用制備的LcWap65-2特異性抗血清檢測誘餌載體在Y187中的表達。 理論上，pGBKT7空載體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（147個氨基酸）和部分載體序列編碼的氨基酸（28個氨基酸）與LcWap65-2（46.75 kD）連接成融合蛋白（BD-LcWap65-2m），計算分子量約為66.0 kD。Western blot檢測結(jié)果（圖4）顯示，未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的Y187總蛋白無特異條帶，轉(zhuǎn)化有誘餌載體的酵母總蛋白有特異性條帶出現(xiàn)，而且條帶大小與預(yù)期相符，表明誘餌蛋白LcWap65-2m在Y187中穩(wěn)定表達，并具有免疫活性。

圖4 Western blot分析誘餌蛋白LcW ap65-2m在Y87中的表達

2.5 誘餌蛋白LcWap65-2m的毒性測定

挑取pGBKT7-LcWap65-2m/Y187單菌落（直徑約為2-3 mm）至50 mL SD/-Trp/Kan（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)（250 r/min）24 h，測得菌液OD600為1.31，符合進一步進行酵母雙雜交實驗所要求的≥0.8。結(jié)果表明，誘餌蛋白LcWap65-2m對酵母菌株Y187無毒性作用。

2.6 誘餌蛋白LcWap65-2m的自激活鑒定

將pGBKT7-LcWap65-2m/Y187涂布于SD/-Trp/ X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal和 SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上，30℃培養(yǎng)3-5 d，觀察到pGBKT7-LcWap65-2m /Y187能在SD/-Trp/X-α-gal平板上生長但不顯藍（圖5-A），在SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板均不能生長（圖5-B，C）。結(jié)果表明，誘餌質(zhì)粒表達的誘餌蛋白LcWap65-2m無自激活特性，不能自激活Y187的報告基因。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是利用雜交基因通過激活報告基因的表達探測蛋白與蛋白的相互作用，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學、細胞信號轉(zhuǎn)導和功能基因組學等領(lǐng)域，已成為現(xiàn)代分子生物學研究領(lǐng)域一個很重要的實驗手段［16，17］。目前，酵母雙雜交技術(shù)在水產(chǎn)動物免疫蛋白篩選、病原與宿主蛋白互作等研究中也得到較為廣泛的應(yīng)用。例如，Chen等［18］以香魚白細胞衍生趨化因子2（Leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2）為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)從香魚肝組織cDNA文庫篩選到2個與LECT2互作的蛋白，分別為C型凝集素受體（C-type lectin receptor）和轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）；李杰等［19］利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到2個與草魚呼腸孤病毒NS38相互作用的蛋白，其中1個為40S核糖體蛋白的S16亞基。本研究使用Clontech公司的Gal4 酵母雙雜交系統(tǒng)，能提供更為嚴格的報告基因篩選方法，具有轉(zhuǎn)化效率高、假陽性率低的優(yōu)點。

圖5 誘餌蛋白LcW ap65-2m自激活作用檢測

本實驗成功構(gòu)建了LcWap65-2m的酵母雙雜交誘餌載體，將其轉(zhuǎn)化Y187酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGBKT7-LcWap65-2m/Y187能在SD/-Trp平板上生長，直徑達1.5-2.0 mm。由于某些蛋白自身能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子從而直接激活報告基因的表達，本實驗驗證了誘餌蛋白LcWap65-2m的自激活作用，結(jié)果表明，pGBKT7-LcWap65-2m/Y187在SD/-Trp/X-α-gal平板上能生長但不顯藍，在SD/-His/-Trp/X-αgal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上不生長，表明誘餌蛋白未激活酵母報告基因，無法分解X-α-gal，無自激活活性。此外，由于某些蛋白質(zhì)的表達對酵母菌株可能產(chǎn)生一定的毒性作用，本實驗測定了pGBKT7-LcWap65-2m/Y187單菌落在SD/-Trp/Kan培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h后菌液的吸光值，結(jié)果OD600大于0.8，表明融合蛋白對Y187無毒性作用。因此，本實驗構(gòu)建的pGBKT7-LcWap65-2m誘餌質(zhì)粒滿足檢測蛋白質(zhì)相互作用的需要，后續(xù)通過酵母雙雜交系統(tǒng)可進一步研究其與上下游分子間的交互作用，為研究Wap65-2在免疫應(yīng)答中的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LcWap65-2m，該誘餌質(zhì)粒能夠在酵母細胞中成功表達融合蛋白，且無自激活作用和毒性作用。研究結(jié)果為進一步利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與Wap65-2相互作用的蛋白奠定基礎(chǔ)。

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（責任編輯 李楠）

Construction and Identification of a Bait Vector for the M ature Peptide of Wap65-2 of Large Yellow Croaker in Yeast Two-Hybrid System

Qiu Tianxiu1，2Li Changhong2Chen Jiong2
（1. College of Science and Technology，Ningbo University，Ningbo315211；2. Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo315211）

The mature peptide of Wap65-2 gene（LcWap65-2m）in large yellow croaker（Larimichthys crocea）was used to construct the yeast two-hybrid bait vector， and its self-activation and toxic effect were measured. LcWap65-2m from the liver cDNA of large yellow croaker was amplified， and cloned into the plasmid pGBKT7. After verification by PCR amplification， enzyme digestion and sequencing， the bait vector pGBKT7-LcWap65-2m was transformed into the yeast strain Y187. The self-activation and toxic effect of the recombinant protein were detected in selective nutrition medium， and the expression of the bait protein LcWap65-2m was analyzed by Western blot. LcWap65-2m was successfully amplified and inserted into the plasmid vector pGBKT7. Western blot analysis showed that the bait protein LcWap65-2m was expressed in yeast cells；phenotypic screening tests revealed that the bait protein LcWap65-2m had no self-activation activity and toxic effect. In conclusion， the yeast two-hybrid bait vector pGBKT7-LcWap65-2m was successfully constructed， which laid the foundation for screening the protein interacted with the bait protein Wap65-2 using the yeast two-hybrid system.

Wap65-2；yeast two-hybrid；expression；self-activation；toxic effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.016

2014-12-01

國家自然科學基金項目（31402333），高等學校博士學科點專項科研基金項目（20133305120008），寧波市自然科學基金項目（2013A610160），浙江省教育廳科研項目（理）（Y201327619）

裘天休，女，研究方向：魚類分子免疫學；E-mail：qt618@163.com

李長紅，女，研究方向：魚類分子免疫學；E-mail：lichanghong0716@163.com