甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP檢測方法的建立

呂沁風 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，杭州　310003）

甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP檢測方法的建立

呂沁風 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，杭州310003）

建立一種新型等溫擴增檢測方法，用于提高等溫擴增反應(yīng)的檢測速度，應(yīng)用于甲型H1N1流感病毒檢測。根據(jù)HA基因設(shè)計一組引物，包括外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物及套內(nèi)引物，套內(nèi)引物的加入增加了引物與模板的接觸位點，提高擴增效率，縮短檢測時間。結(jié)果顯示，F(xiàn)AST-LAMP檢測法比普通LAMP檢測法時間縮短45 min左右，比加入環(huán)引物的LAMP檢測方法縮短20 min，大大縮短了反應(yīng)的檢測時間。檢測靈敏度可達到1×102拷貝。FAST-LAMP是一種高效、更快的檢測方法。

FAST-LAMP；甲型H1N1流感病毒；檢測

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增技術(shù)，該方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種引物，在等溫60-65℃條件下利用Bst聚合酶即可進行109-1010倍的核酸擴增［1，2］。LAMP產(chǎn)物通過濁度或者熒光變化可用肉眼觀察，具有操作簡便、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點［3，4］。自2000年環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)問世以來，該方法在病原體檢測、疾病診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［5-8］。如何在現(xiàn)有的LAMP技術(shù)基礎(chǔ)上，發(fā)掘更高效快速的等溫擴增方法，成為重要的研究方向，目前最快速的LAMP反應(yīng)方法是加入環(huán)引物［9，10］。本研究設(shè)計一種新型快速的等溫擴增方法，改變其現(xiàn)有的引物設(shè)計方法，使環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)擴增完成的時間比加入環(huán)引物所用的時間更短。

流行性感冒病毒，屬于正黏液病毒科，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，它會造成急性上呼吸道感染，并在空氣中迅速傳播，在世界各地常會有周期性的大流行［11，12］。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感病毒是變異最為頻繁的一個類型［13］。2009年起源于墨西哥的的甲型H1N1流感病毒爆發(fā)流行造成全球數(shù)千萬人大流行，死亡人數(shù)達到1 800多人［14，15］。在大流行后期，該病毒仍在流行，實驗室檢測證實該病毒在2013年仍為歐洲、亞洲等地流感的流行株［16-23］。2013年美國、中國內(nèi)地仍有死亡病例報道［24-27］。本試驗以甲型H1N1流感為例研究新型快速等溫擴增檢測，旨在為了建立新型等溫擴增方法，提高檢測速度提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購用QIAGEN公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，Bst-DNA polymerase購自NEB公司。TaKaRa Ex Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司，RNase Inhibitor購自Fermentas公司，MgSO4和Betain為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，EVA Green購自Biotium公司、DNA Marker DL2000和瓊脂糖Agrose 購自TaKaRa公司。甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、副流感病毒、人偏肺病毒等為本室保存。

1.1.2 儀器 2720型PCR儀和7500型熒光定量PCR儀購置購自ABI公司，電泳儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 常規(guī)LAMP技術(shù)含有一對外引物，一對內(nèi)引物，選擇加入一對環(huán)引物，可在等溫條件下進行核酸擴增。本研究根據(jù)甲型H1N1流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守區(qū)設(shè)計一組引物族［20，27］，引物的設(shè)計是在帶有環(huán)引物的外FIP1和外BIP1的擴增產(chǎn)物區(qū)域再次設(shè)計內(nèi)FIP2和內(nèi)BIP2引物，使得FIP1和BIP1的產(chǎn)物能再次成為FIP2和BIP2的LAMP擴增模板，F(xiàn)IP1和BIP2、FIP2和BIP1也同時形成正常的LAMP擴增系統(tǒng)。即本套引物同時形成了4套獨立的LAMP擴增系統(tǒng)，從而使擴增速率增加。引物序列，見表1。

表1 甲型H1N1流感病毒核酸FAST-LAMP擴增引物

1.2.2 病毒RNA的提取 嚴格按QIAGEN RNA抽提試劑盒說明書提取病毒RNA，溶于100 μL無RNase水中，-70℃保存。

1.2.3 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 FAST-LAMP反應(yīng)體系如下：10×buffer 2.5 μL，引物混合物1 μL（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L， FNP、BNP各15 μmol/L），模板RNA 1 μL，8 U Bst-DNA聚合酶1 μL，10 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，甜菜堿（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20× 的 Eva green加入DEPC-H2O補足25 μL。普通RT-LAMP反應(yīng)體系除引物混合物為（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各 1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各 15 μmol/L），加入環(huán)引物的引物混合物為（F3、B3各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L），其他與FAST-LAMP一致，反應(yīng)條件為：63℃，55 s，熒光采集5 s，100個循環(huán)在熒光定量PCR儀（Chromo4-Bio-Rad公司）中進行。引物混合物中各引物濃度，見表2。

1.2.4 靈敏度試驗 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機引物法將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用PCR引物進行擴增，將PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進行純化回收，對純化后的PCR產(chǎn)物測定OD值，根據(jù)產(chǎn)物長度和OD值進行copies數(shù)計算。將cDNA進行10倍遞進稀釋，取1 μL作為模板加入反應(yīng)體系中，在63℃恒溫條件下，反應(yīng)60 min。在熒光定量PCR儀上觀察實時熒光反應(yīng)圖，并取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 特異性試驗 利用FAST-LAMP反應(yīng)體系，以H3N2、乙型流感、水痘病毒、人偏肺病毒、副流感病毒等核酸作為待測樣品進行檢測，觀察實時熒光反應(yīng)，并將擴增產(chǎn)物進行電泳分析。

1.2.6 重復(fù)性試驗 根據(jù)靈敏度試驗結(jié)果選擇陰性、1×102copies/μL、1×104copies/μL和 1×106copies/μL濃度的cDNA模板分別進行FAST-LAMP，每份樣本各取1 μL重復(fù)3次，采用實時熒光定量PCR儀進行檢測，觀察反應(yīng)的Ct值，根據(jù)Ct值計算變異系數(shù)，對該方法的重復(fù)性進行考核。

表2 各反應(yīng)體系中的引物組成及引物濃度

1.2.7 擴增方法反應(yīng)時間比較 將普通LAMP、加入環(huán)引物LAMP和FAST-LAMP反應(yīng)采用同一樣本同時檢測，反應(yīng)條件為63℃，55 s，熒光采集5 s，100個循環(huán)。

1.2.8 產(chǎn)物測序分析 將FAST-LAMP的擴增產(chǎn)物膠回收后進行序列分析，分別采用內(nèi)引物和套內(nèi)引物為測序引物。

1.2.9 樣本檢測 收集浙江口岸機場發(fā)熱人員鼻咽拭子35份，根據(jù)說明書提取RNA，采用FASTLAMP技術(shù)進行檢測。將檢測結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果進行比對。

2 結(jié)果

2.1 不同擴增方法反應(yīng)時間的比較

根據(jù)實時熒光檢測的結(jié)果（圖1）可見，F(xiàn)ASTLAMP的反應(yīng)時間控制在40-45 min左右，加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時間為65 min左右，普通LAMP反應(yīng)時間在90 min左右。

圖1 甲型H1N1流感病毒不同擴增方式實時熒光檢測

2.2 特異性試驗結(jié)果

采用甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP方法進行檢測，電泳反應(yīng)結(jié)果（圖2）顯示，甲型H1N1流感病毒出現(xiàn)與普通LAMP反應(yīng)相似的階梯狀條帶，且條帶比普通LAMP反應(yīng)更多。此外，陰性對照、H3N2病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、人偏肺病毒和副流感病毒核酸的檢測結(jié)果均為陰性，由此顯示了該方法具有較好的特異性。

2.3 靈敏度試驗結(jié)果

在熒光定量PCR儀上觀察實時熒光反應(yīng)圖，結(jié)果見圖2；并取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3，1-5泳道均出現(xiàn)細密的階梯狀條帶，表示出現(xiàn)有陽性擴增反應(yīng)?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測極限約為1×102copies/μL。

圖3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP靈敏度實時熒光曲線

圖4 甲型H1N1流感病毒Fast-LAMP靈敏度電泳結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

根據(jù)實時熒光RT-LAMP的結(jié)果，記錄各次試驗的Ct值。根據(jù)Ct值計算SD值及變異系數(shù)（CV%），見表3。結(jié)果表明強陽性及臨界值樣本的CV值均小于5%，重復(fù)性良好。

2.5 產(chǎn)物測序結(jié)果

由于產(chǎn)物組成的復(fù)雜性，出現(xiàn)了個別堿基錯配，各引物檢測FAST-LAMP產(chǎn)物序列分析的整體結(jié)果表明，套內(nèi)引物FNP和BNP、內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP組合均能擴增出相應(yīng)的產(chǎn)物，環(huán)引物也能與FNP擴展出相應(yīng)的產(chǎn)物。由此可證明本檢測方法中各引物之間確實能各自組合擴增。

表3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP重復(fù)性實驗結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測

采用FAST-LAMP技術(shù)進行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35例機場口岸送檢本實驗室的鼻咽拭子樣本中有8例甲型H1N1流感病毒陽性，與熒光定量PCR檢測結(jié)果相符。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)由于操作簡單，無需昂貴的實驗儀器，反應(yīng)在1-1.5 h內(nèi)完成，靈敏度高，吸引了大量的研究力量投入到了該領(lǐng)域的研究。目前環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)僅僅是在該方法建立基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)有的引物設(shè)計方法檢測目的基因，或是在產(chǎn)物的檢測方式上有所改變，在擴增方式上沒有實質(zhì)性的創(chuàng)新［1-7］。在實時熒光定量PCR擴增儀中觀察LAMP的擴增曲線從Ct值到平臺期的時間非常短，一般均在2 min之內(nèi)［28］，即潛伏期的長短決定了整個反應(yīng)時間的長短。LAMP反應(yīng)是以產(chǎn)物的量為判斷依據(jù)，在普通LAMP中和模板接觸的是一對引物，4個位點決定了LAMP反應(yīng)的內(nèi)在擴增效率，除此之外，引物濃度等的條件優(yōu)化、模板量和酶的量等決定了外在的擴增效率，本研究的創(chuàng)新點在于提高反應(yīng)的內(nèi)在擴增效率。在LAMP反應(yīng)體系中加入環(huán)引物增加了兩個與核酸模板接觸的位點［9］，提高了擴增效率，但不改變產(chǎn)物的種類。如果把引物和模板的結(jié)合位置由4個變?yōu)?個，那么反應(yīng)的產(chǎn)物將由1種變?yōu)?種，理論上能大幅增加擴增效率。

本研究的設(shè)計方案：在目的基因內(nèi)兩端設(shè)計常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物（一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP、BIP），并留出設(shè)計套內(nèi)引物FNP、BNP和環(huán)引物Loop-f、環(huán)引物Loop-r的足夠堿基；加入環(huán)引物Loop-f、環(huán)引物Loop-r，可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加兩個，提高了擴增效率。在外側(cè)內(nèi)引物FIP和BIP之間設(shè)計一對套內(nèi)引物FNP、BNP，此時等溫擴增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進行擴增，同時也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP引物擴增的產(chǎn)物結(jié)合并擴增，使與核酸模板接觸的位置又增加了4個。套內(nèi)引物FNP 不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進行擴增反應(yīng)，同時也能與外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進行擴增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴增的機會；反之，套內(nèi)引物BNP也可以與套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進行擴增反應(yīng)，同時也能與外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進行擴增反應(yīng)。常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴增產(chǎn)物只有1種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴增產(chǎn)物。

在本次試驗中FAST-LAMP的反應(yīng)時間比普通LAMP反應(yīng)時間縮短了45 min左右，比加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時間縮短了15 min左右，在相同條件的情況下大大提高了反應(yīng)的擴增效率。本方法擴增出的LAMP產(chǎn)物為4種不同LAMP組合的混合物的倍數(shù)條帶，陽性條帶大小的差異很小，條帶分布比普通LAMP更加細密，故而梯度狀條帶不是很清晰。本方法的產(chǎn)物經(jīng)電泳割膠回收后測序結(jié)果符合實驗預(yù)期，各引物之間能相互擴增。相比用傳統(tǒng)的LAMP檢測技術(shù)，該方法在檢測時間上大大縮短，普通LAMP用于檢測H1N1病毒仍需在1.5 h左右，且靈敏度與本研究建立的檢測方法相當［29，30］。由于受病毒基因的限制，該檢測方法的改進在細菌檢測、物種鑒定等檢測中具有更大的發(fā)展前景，可將反應(yīng)時間控制更短。

4 結(jié)論

在相同的檢測條件下，本研究建立的改良的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法應(yīng)用于甲型H1N1流感病毒檢測，具有更快的擴增速度。檢測靈敏度可達到1×102拷貝，特異性與重復(fù)性良好；具有簡便、高效、準確的特點。

［1］ Notom T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acid Research， 2000， 28（12）：e63.

［2］Nagamine K， Watanabe K， Ohtsuka K， et al. Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template［J］. Clin Chem， 2001， 47：1742-1743.

［3］Goto M， Honda E， Ogura A， et al. Colorimetric detection of loopmediated isothermal amplification reaction by using hydroxyl naphthol blue［J］. Biotechniques， 2009， 46：167-172.

［4］Mori Y， Nagamine K， Tomita N， Notomi T. Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001， 289：150-154.

［5］ Lyu QF， Che Y， Zhang W， et al. Establishment of reserve transcription loop-mediated isothermal amplification method for Yellow fever virus［J］. Microbiology China， 2014， 41（1）：184-190.

［6］ Zhao Z， Fan B， Wu G， et al， Development of loop-mediated isothermal amplification assay for specific and rapid detection of differential goat Pox virus and Sheep Pox virus［J］. BMC Microbiol， 2014， 14（1）：10.

［7］Su JY， Liu XC， Cui HM， et al， Rapid and simple detection of methicillinresistance staphylococcus aureus by orfX loop-mediated isothermal amplification assay［J］. BMC Biotechnol， 2014， 24；14（1）：8.

［8］Tomita N， Mori Y， Kanda H， Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products［J］. Nature Protoc， 2008， 3：877-882.

［9］Nagamine K， Hase T， Notomi T. Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers［J］. Mol Cell Probes， 2002， 16（3）：223-229.

［10］Ihira M， Yoshikawa T， Enomoto Y， et al. Rapid diagnosis of human herpesvirus 6 infection by a novel DNA amplification method， loopmediated isothermal amplification［J］. J Clin Microbiol， 2004， 42（1）：140-145.

［11］Valleron AJ， Cori A， Valtat S， et al. Transmissibility and geographic spread of the 1889 influenza pandemic［J］. Proc Natl Acad SciUSA， 2010， 107（19）：8778-8781.

［12］Mills CE， Robins JM， Lipsitch M. Transmissibility of 1918 pandemic influenza［J］. Nature， 2004， 432（7019）：904-906.

［13］LeBlanc JJ， Li Y， Bastien N， et al. Switching gears for an influenza pandemic：validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic（H1N1）2009 Influenza Virus［J］. J Clin Microbiol，2009， 47（12）：3805-3813.

［14］Influenza A（H1N1）-update 103. World Health Organization. 2010-06-04 Retrieved 2010-10-16

［15］WHO（2013）Influenza update Nu182. 182：3-4. Available：http：//www. who. int/influenza/surveillance_monitoring/ updates/2013-04-02_surveillance_update 182. pdf.

［16］de la Rosa-Zamboni D， Vázquez-Pérez JA， Avila-Ríos S， et al. Molecular characterization of the predominant influenza A（H1N1）pdm09 virus in Mexico， December 2011-February 2012［J］. PLoS One， 2012， 7（11）：e50116.

［17］ Wu C， Cheng X， Wang X， et al. Clinical and molecular characteristics of the 2009 pandemic influenza H1N1 infection with severe or fatal disease from 2009 to 2011 in Shenzhen， China［J］. J Med Virol， 2013， 85（3）：405-412.

［18］ Brooke RJ， VAN Lier A， Donker GA， et al. Comparing the impact of two concurrent infectious disease outbreaks on The Netherlands population， 2009， using disability-adjusted life years［J］. Epidemiol Infect， 2014， 24：1-10.

［19］ Gomez-Barroso D， Martinez-Beneito MA， Flores V. Geographical spread of influenza incidence in Spain during the 2009 A（H1N1）pandemic wave and the two succeeding influenza seasons［J］. Epidemiol Infect， 2014， 27：1-13.

［20］ Dakhave M， Khirwale A， Patil K， et al. Whole-genome sequence analysis of postpandemic influenza A（H1N1）pdm09 virus isol-ates from India［J］. Genome Announc， 2013， 1（5）：e00727-13.

［21］ Chudasama RK， Patel UV， Verma PB. Characteristics of hospitalized patients with severe and non-severe pandemic influenza A（H1N1）in Saurashtra region， India（two waves analysis）［J］. J Family Med Prim Care， 2013， 2（2）：182-187.

［22］ Kiertiburanakul S， Morasert T， Sirinavin S， et al. Comparisons of clinical characteristics between adult patients with 2009 H1N1 influenza and those with seasonal influenza during the 2009 Epidemic in Thailand［J］. Jpn J Infect Dis， 2014， 67（1）：33-39.

［23］Wang XL， Wong CM， Chan KH， et al. Hospitalization risk of the 2009 H1N1 pandemic cases in Hong Kong［J］. BMC Infect Dis，2014， 14（1）：32.

［24］North Texas confirmed 20 flu deaths［Last accessed on 2014-01-08］. Available from：http：//news. xinhuanet. com/english/ world/2014-01/08/c_133026240. htm

［25］http：//news. sina. com. cn/c/2013-04-03/222126728529. shtml

［26］ Ren YY， Yin YY， Li WQ， et al. Risk factors associated with severe manifestations of 2009 pandemic influenza A（H1N1）infection in China：a case-control study［J］. Virol J， 2013， 10：149.

［27］ Choi JH， Kim MS， Lee JY， et al. Development and evaluation of multiplex real-time RT-PCR assays for seasonal， pandemic A/H1pdm09 and avian A/H5 influenza viruses detection［J］. J Microbiol， 2013， 51（2）：252-257.

［28］ Mori Y， Kitao M， Tomita N， Notomi T. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA［J］. J Biochem Biophys Methods， 2004， 59：145-157.

［29］聶凱， 王大燕， 秦萌， 等. 基于顏色判定的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)檢測人甲型H1N1 流感病毒基因［J］. 病毒學(xué)報，2010， 26（2）：81-87.

［30］王翔， 張騫， 張鈁， 等. 甲型H1N1流感病毒HA基因RTLAMP 檢測方法的建立與初步應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通訊，2011， 22（5）：696-708.

（責任編輯 李楠）

The Establishment of FAST-LAMP Method for Detecting Influenza A（H1N1）Virus

Lü Qinfeng Luo Peng He Lei Yang Yongyao Zheng Wei Li Li Wu Zhonghua
（Zhejiang International Travel Healthcare Center，Hangzhou310003）

It was to establish a new loop-mediated isothermal amplification（FAST-LAMP）for rapidly detecting influenza A（H1N1）virus. A set of primers were designed according to HA gene， including the outer primers， internal primers， loop primers and nest internal primers. The nest internal primers increased the contact sites of primers and nucleic acid template， so that the amplification efficiency could be improved and detection time reduced. The FAST-LAMP method could be 45 less than LAMP method， and 20 minutes less than LAMP method with loop primers， i.e. detection time reduced significantly detecting sensitivity reached 1×102copies cDNA template/tube. It proved that the established FAST-LAMP method is an efficient and reliable method for detecting influenza A（H1N1）virus.

FAST-LAMP；H1N1 influenza virus；detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.013

2014-08-14

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項項目（201010043），國家質(zhì)檢總局科技項目（2013IK245）

呂沁風，女，碩士，副主任技師，研究方向：傳染病檢測；E-mail：fionallll@163.com