CBHⅡ和EGⅣ的重構(gòu)基因在里氏木霉中的組成型表達(dá)

曾敏，鄧麗瑜，湯新，劉剛，余少文，*

（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

CBHⅡ和EGⅣ的重構(gòu)基因在里氏木霉中的組成型表達(dá)

曾敏1，2，鄧麗瑜1，湯新1，劉剛1，余少文1，*

（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4表達(dá)的融合蛋白同時(shí)獲得具有外切葡聚糖酶CBH II和內(nèi)切葡聚糖酶EG IV 2種催化活性，在纖維素降解等方面有著重要應(yīng)用。本研究通過overlap PCR將里氏木霉丙酮酸脫羧酶（PDC）的啟動(dòng)子、纖維二糖水解酶cbh1的信號(hào)肽、重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4和pdc終止子依次連接，以質(zhì)粒pPICZαA為基本骨架，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC-PCT。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pPIC-PCT和含潮霉素抗性篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pAN7-1共轉(zhuǎn)里氏木霉。SDS-PAGE分析表明，重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4實(shí)現(xiàn)了在里氏木霉中的組成型表達(dá)，測得重組木霉發(fā)酵上清液的CMCNa酶活最高達(dá)到4.08 U/mL，是出發(fā)菌株的5.55倍，F(xiàn)PA酶活達(dá)到0.915 U/mL，較出發(fā)菌株提高了43.6%。酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明：粗酶液的最適pH為5.0，最適溫度為50℃。

基因重構(gòu)；外切葡聚糖酶Ⅱ；內(nèi)切葡聚糖酶Ⅳ；丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子

纖維素酶能有效降解纖維素，將其水解成葡萄糖，廣泛應(yīng)用于紡織、食品加工、釀酒、造紙和飼料等領(lǐng)域，對解決環(huán)境污染和能源危機(jī)具有重大意義［1-2］。纖維素酶廣泛存在于多種微生物中，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前研究最透徹的產(chǎn)纖維素酶模式菌株［3-4］，它產(chǎn)生的纖維素酶主要由內(nèi)切型葡聚糖酶（endo-glucanases，EG）、外切型葡聚糖酶（exo-cel－lobiohydrolase，CBH）以及β-葡萄糖苷酶（β-Glucosi dase，簡稱BG）組成［5-7］，它們通過協(xié)同作用降解纖維素［8］。其中只有CBH可作用于纖維素結(jié)晶區(qū)域，從纖維素分子的非還原端進(jìn)行水解，而自然界中的木質(zhì)纖維素大都呈結(jié)晶狀態(tài)，因此CBH在纖維素降解過程中的作用非常重要。纖維素酶有2個(gè)活性區(qū)域：催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domains，CD）和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)（celluose-binding domains，CBD）［9-10］，其中CD是纖維素酶的“活性中心”，在水解過程中起著重要作用。

根據(jù)纖維素酶各組分間的協(xié)同作用研究，人們發(fā)現(xiàn)適當(dāng)改變各組分的比例可提高纖維素酶的降解效率。近年來，從分子結(jié)構(gòu)水平改造纖維素酶基因，提高纖維素酶的生物學(xué)活性已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。Lemos［11］等在基因cbh2和eg中增加CBD基因，提高了這兩種纖維素酶的活性。劉剛等［12］在eg4基因中增加一個(gè)其自身的CD基因，使其重組蛋白活性提高了4倍。本實(shí)驗(yàn)室在cbh2下游增加eg4的CD基因，得到含2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4。本研究將該基因與里氏木霉丙酮酸脫羧酶的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子（含信號(hào)肽）融合，構(gòu)建里氏木霉組成型表達(dá)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以期得到可以高效表達(dá)融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ且具有較高酶活力的重組木霉。

1　材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒

T.reesei QM9414、大腸桿菌E.coli Top10F’、質(zhì)粒pPICZαA、pAN7-1由本實(shí)驗(yàn)室保藏。pMD18-T simple vector購自TaKaRa公司。質(zhì)粒pPIC-cbh2，pPIC-eg4由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2培養(yǎng)基

Mandels基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100 mL/L，Mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，無水葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，1 M的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.0 g/L～2.0 g/L。

篩選培養(yǎng)基：含有STC和潮霉素100 μg/mL的PDA培養(yǎng)基。其中，STC、葡萄糖和PDA培養(yǎng)基的其他成分分為3部分各溶于約1/3的水中。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：50×Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液20 mL/L，1 000×Mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，黃豆餅粉50 g/L，1 M檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫80 1.0 g/L～2.0 g/L，葡萄糖30 g/L。

1.3表達(dá)載體pPIC-PCT的構(gòu)建

分別以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC-eg4、pPIC-cbh2為模板，根據(jù)NCBI公布eg4、cbh2序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR獲得基因片段linkereg4、CDeg4和cbh2。依次經(jīng)雙酶切連接至質(zhì)粒pPICZαA，重構(gòu)質(zhì)粒pPIC-cbh2-linker-CDeg4。

以里氏木霉基因組DNA為模板，根據(jù)Genebank報(bào)道的序列設(shè)計(jì)引物，分別經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得纖維二糖水解酶I信號(hào)肽序列Scbh1、丙酮酸脫羧酶啟動(dòng)子Ppdc和終止子Tpdc序列。利用overlap PCR技術(shù)依次連接PSpdc、cbh2-linker-CDeg4、Tpdc，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC-PCT。

1.4里氏木霉的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及篩選

表達(dá)載體pPIC-PCT經(jīng)Xba I酶切純化處理后，與含潮霉素篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pAN7-1共轉(zhuǎn)T.Reesei，主要參照Penttila等的方法進(jìn)行［13］。取適量轉(zhuǎn)化液涂布到含有100 μg/mL潮霉素的PDA平板上，28℃培養(yǎng)觀察3 d～5 d至平板上長出菌絲，挑取單菌落菌絲轉(zhuǎn)接至100 μg/mL潮霉素的PDA小平板上進(jìn)行復(fù)篩，28℃培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)接至新鮮無抗性PDA小板上培養(yǎng)7 d～10d。

1.5重組木霉的組成型表達(dá)

用無菌水刮取PDA培養(yǎng)平板上生長7 d的木霉轉(zhuǎn)化子孢子，接種至含潮霉素抗性的Mandels基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)1.5 d～2 d。以5%的接種量轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)。11 000 r/min，離心10 min，收集上清，即為粗酶液，每24 h取樣一次檢測粗酶液的酶活力。

1.6重組木霉的PCR鑒定

以重組木霉基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4，以木霉基因組DNA為對照，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并測序。

1.7重組木霉表達(dá)產(chǎn)物的分析

SDS-PAGE電泳：取粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE，分析融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的表達(dá)情況。

CMCNa酶活的測定：采用DNS法測定內(nèi)切葡聚糖酶的活性［14］，酶活力單位（U）定義為1 min水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。取適當(dāng)稀釋后的粗酶液0.5 mL與1%CMC-Na（用0.05 M檸檬酸緩沖液配制，pH4.8）于50℃水浴中反應(yīng)30 min，立即加入3 mL DNS終止酶反應(yīng)，充分混勻，沸水浴5 min，冷卻，充分混勻后測OD540。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。

濾紙酶活（FPA）的測定：取0.5 mL適當(dāng)稀釋后的粗酶液、1 mL檸檬酸緩沖液（0.05 M，pH4.8）及50 mg的濾紙條（Whatman NO.1）在50℃水浴中反應(yīng)30 min，立即加入3mLDNS終止酶反應(yīng)，充分混勻，沸水浴5min，冷卻，充分混勻后測OD540。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。

1.8重組木霉酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

酶反應(yīng)的最適pH：分別配制pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液，在對應(yīng)pH條件下進(jìn)行CMCNa酶活測定。

酶反應(yīng)的最適溫度：分別在30、40、50、60、70、80℃下進(jìn)CMCNa酶活測定。

2　結(jié)果與分析

2.1表達(dá)載體的構(gòu)建

通過酶切連接法獲得大小為2 205 bp的重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4，將該基因插入PSpdc和Tpdc之間，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC-PCT，大小約為7 000 bp，其測序結(jié)果與預(yù)期相符，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（如圖1）。

圖1　表達(dá)載體pPIC-PCT的酶切鑒定Fig.1Enzyme digestion of the recombined plasmid pPIC-PCT

2.2重組木霉的PCR鑒定

如圖2所示：可在大部分重組木霉的基因組中擴(kuò)增到重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4，且測序結(jié)果與預(yù)期一致，表明重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4已成功整合到到里氏木霉基因組中。

圖2　重組木霉基因組的PCR鑒定Fig.2Identification of recombinant T.reesei by PCR

2.3SDS-PAGE分析

融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ在pdc啟動(dòng)子的調(diào)控下，成功實(shí)現(xiàn)了在里氏木霉中的組成型表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明（圖3），融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的分子量約為100 KD，大于理論值80.56 KD，推測是重組蛋白在表達(dá)時(shí)發(fā)生了糖基化修飾。

圖3　重組木霉的SDS-PAGE分析Fig.3Analysis of of recombinant T.reesei by SDS-PAGE

2.4重組木霉菌株的酶活測定

在相同條件下對重組木霉菌株及出發(fā)菌株進(jìn)行組成型產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，測得重組木霉A4的CMCNa酶活最高，達(dá)到4.08 U/mL（圖4），是出發(fā)菌株的5.55倍。重組木霉A4的FPA酶活為0.915 U/mL（圖5），較出發(fā)菌株提高了43.6%。由于初始菌體濃度較低，前48 h內(nèi)幾乎檢測不到A4的CMCNa酶活和FPA酶活，96、84 h其酶活分別達(dá)到最高。培養(yǎng)108 h時(shí)，CMCNa酶活和FPA酶活均下降，可能是由于融合蛋白被里氏木霉自身分泌的蛋白酶所降解。

圖4　重組木霉A4的CMCNa酶活Fig.4CMCNaactivity of recombinant T.reesei

圖5　重組木霉A4的FPA酶活Fig.5FPA activity of recombinant T.reesei

2.5酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

如圖6所示，粗酶液的最適pH為5.0，在pH為4.0～5.5范圍內(nèi)相對酶活較高，pH過低或過高都對酶活有較大影響。

圖6　粗酶液的最適pHFig.6The optimum pH of crude enzyme

如圖7所示，粗酶液的最適反應(yīng)溫度為50℃，在50℃～60℃范圍內(nèi)相對酶活較高，在70℃時(shí)還能保持最高酶活的66.6%，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，酶活急劇下降。

圖7　粗酶液的最適溫度Fig.7The optimum temperature of crude enzyme

3　結(jié)論與討論

纖維素酶應(yīng)用廣泛，但因酶活低、成本高等因素不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用［15］。近年來，通過基因工程技術(shù)來獲得高活性、高產(chǎn)量的纖維素酶逐漸受到重視。本研究對纖維素酶cbh2和eg4進(jìn)行重構(gòu)，獲得具有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的重構(gòu)基因，它表達(dá)的蛋白具有這2種纖維素酶組分的催化活性，在實(shí)際應(yīng)用中具有更廣闊的前景。

里氏木霉能高效合成和分泌蛋白質(zhì)，是高產(chǎn)纖維素酶的代表菌種。它常使用cbh1啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)［16-18］，實(shí)現(xiàn)目的基因的同源或異源表達(dá)，但cbh1啟動(dòng)子需要纖維素或乳糖的誘導(dǎo)才能調(diào)控目的基因的表達(dá)。此外，誘導(dǎo)物也能誘導(dǎo)里氏木霉其它纖維素酶的表達(dá)，加大了目的蛋白分離、純化的難度。LI等［19］通過RT-qPCR技術(shù)從里氏木霉中篩選出可以使木聚糖酶Ⅱ基因（xyn2）高效表達(dá)的pdc啟動(dòng)子，且里氏木霉分泌的總蛋白中約83%是XYN2蛋白。WANG等［20］利用pdc啟動(dòng)子調(diào)控康氏木霉纖維素酶轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1的表達(dá)，結(jié)果顯著提高了纖維素酶的活性。pdc組成型啟動(dòng)子所構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)無需誘導(dǎo)物，能在富含葡萄糖的培養(yǎng)條件下啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。里氏木霉自身分泌蛋白較少，能有效解決目的蛋白的分離及純化問題。本研究利用pdc啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4在里氏木霉中的組成型表達(dá)，其CMCNa酶活達(dá)到4.08 U/mL，是出發(fā)菌株的5.55倍，F(xiàn)PA酶活達(dá)到0.915 U/mL，較出發(fā)菌株提高了43.6%，大大提高了酶活力。

綜上所述，重構(gòu)基因cbh2-linker-CDeg4在pdc啟動(dòng)子的調(diào)控下，實(shí)現(xiàn)了在里氏木霉中的組成型高效表達(dá)，且雜蛋白較少，容易提純。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，粗酶液的最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為50℃。cbh2-linker-CDeg4同時(shí)具有cbh2和eg4的催化活性，在食品、飼料、紡織等工業(yè)有著廣泛應(yīng)用前景。今后，我們將對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，通過改變對酶活影響較大的3個(gè)因素（碳源、氮源、無機(jī)鹽）來確定最優(yōu)培養(yǎng)方案，進(jìn)一步提高該融合蛋白的酶活。今后將對該蛋白進(jìn)行純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)做詳細(xì)研究。

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Construction of CBH II and EG IV for Homologous Protein Expression with Constitutive Promoter in Trichoderma Reesei

ZENG Min1，2，Deng Li-yu1，TANG Xin1，LIU Gang1，YU Shao-wen1，*
（1.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong，China；2.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，Shenzhen 518060，Guangdong，China）

The reconstructed gene cbh2-linker-CDeg4gain two kinds of cellulase catalytic properties，which added the catalytic domain（CD）gene from eg4 to the 3'end of cbh2.The gene cbh2-linker-CDeg4was inserted between T.reesei QM9414 strong promoter PSpdc（including secreting signal peptide sequence）and terminator Tpdc，generating reconstructed plasmid pPIC-PCT.The plasmid pPIC-PCT and plasmid pAN7-1 were transformed into T.reesei via an improved protoplast transformation.SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein CBHⅡ-EGⅣhad successfully expressed in T.reesei.The CMCNaactivity of the T.reesei recombinants could reach 4.08 U/mL，which is 5.55-fold as high as that of the host strain；the FPA cativity could reach 0.915 U/mL，which were increased by 43.6%.The cellulase characterization of recombinant showed that the optimum pH value was about 5.0，and the optimum reaction temperature was at 50℃．

gene recombination；cellobiohydrolaseⅡ；endo-β-1，4-glucanaseⅣ；pyruvate decarboxylase promoter

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.032

2014-03-12

深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃（JCYJ20120613115323982）

曾敏（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：酶工程。