豬肉中四環(huán)素殘留快速檢測法的研究

鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

豬肉中四環(huán)素殘留快速檢測法的研究

鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

對(duì)豬肉樣品的四環(huán)素殘留量檢測的研究。以高效液相色譜法（HPLC）檢測豬肉組織中四環(huán)素殘留，并對(duì)這種方法的提取及測定條件等方面進(jìn)行了探討。確定最佳提取條件是用5%高氯酸溶液25 mL提取樣品中四環(huán)素殘留，選擇最佳測定條件是色譜柱為ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm），柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10 μL，波長為265 nm，流速為1.0 mL/min。

高效液相色譜法；豬肉；四環(huán)素

四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素之一。而四環(huán)素類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都屬于氫化駢四苯環(huán)衍生物，并且在近可見區(qū)（270 nm附近）具有強(qiáng)紫外吸收，干燥條件下四環(huán)素族較穩(wěn)定，但遇光易變色。在弱酸性溶液中相對(duì)穩(wěn)定，在酸性溶液（pH＜2）、中性或堿性（pH＞7）均易發(fā)生降解而失效。在酸性條件下，易脫水，消除生成橙黃色脫水物，抗菌活性減弱或完全消失。在堿性條件下，生成具有內(nèi)酯的異構(gòu)體［1］。

四環(huán)素（Tetracycline，TC），又稱去甲金霉素，分子式為C22H24N2O8，分子量444.45，是從放線菌金色鏈叢菌的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)。黃色晶體，熔點(diǎn)170℃～175℃。微溶于水、乙醇和丙酮，在空氣中穩(wěn)定，但易吸收水分，受強(qiáng)日光照射變色。當(dāng)人體中的四環(huán)素含量達(dá)到一定量時(shí)，可以對(duì)人體產(chǎn)生多種急慢性中毒，導(dǎo)致人體多種器官的病變［2］。在我國豬肉組織中四環(huán)素殘留量最大限值為0.25 mg/kg［3］。

本文采用高效液相色譜法（HPLC）檢測四環(huán)素在豬肉可食組織中四環(huán)素殘留量［4］。此方法不僅操作簡便，而且靈敏度和特異性高，可用于動(dòng)物組織中四環(huán)素殘留量的檢測分析。

1　材料與方法

1.1試劑及配置

乙腈（分析純）；0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液；0.01 mol/L草酸甲醇溶液；0.01 mol/L三氟乙酸溶液；0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine緩沖液平衡（pH=4.0）；四環(huán)素（TC）標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 mg/mL）；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 mg/L）；5%高氯酸溶液；5%甲醇溶液。

豬肉：江蘇省淮安市沃爾瑪超市的冷鮮肉。

1.2主要儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（HPLC），配有紫外檢測器：美國Agilent公司；32R型離心機(jī)：德國HettichUNIVERAL公司；固相萃取裝置：美國Waters公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；測波長：265 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L。

1.3.2樣品提取方法的確定

樣品的提取是指用適當(dāng)?shù)娜軇┌汛郎y組分從復(fù)雜樣品基質(zhì)中提取至易于凈化和分析的液體狀態(tài)。

1.3.2.1液-液萃取法

液-液萃取法是指被測物的性質(zhì)在酸或堿性條件下提取凈化［4］。該方法操作簡便，但耗費(fèi)時(shí)間，耗費(fèi)有機(jī)溶劑，并且溶劑中容易引入新的雜質(zhì)。還有的溶劑的大量揮發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員健康會(huì)造成較大的危害，樣品經(jīng)多次轉(zhuǎn)移濃縮會(huì)造成的分析誤差較大，回收率較低。

1.3.2.2固相萃取法

固相萃取法是采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、純化。該方法與傳統(tǒng)的液——液萃取法相比，具有明顯的優(yōu)勢［5］。不僅提高了樣品的處理通量，排除了基質(zhì)對(duì)樣品的影響能力，而且大大減少了溶劑的消耗，回收率高、重現(xiàn)性好，雜質(zhì)干擾極低，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等，是目前獸藥殘留分析樣品前處理中的主流技術(shù)。

1.3.2.3微波輔助萃取法

微波輔助萃取法是一種萃取速度快、溶劑用量少、回收率高、靈敏以及易于自動(dòng)控制的新固態(tài)樣品提取技術(shù)。該方法在回收率和重復(fù)性上優(yōu)于其他萃取方法，同時(shí)不受含水量的影響，但此方法還未普及推廣。

綜合上述得，本文采用固相萃取法對(duì)豬肉進(jìn)行提取為最佳提取方法。

1.3.3樣品的制備

將豬肉切碎，于組織勻漿機(jī)中勻漿，備用。

1.3.4樣品的提取

精確稱取絞碎后的豬肉樣品5.000 0 g，置于50 mL離心管中，渦旋，震蕩，加入25 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖溶液提取，搖勻，再加入2 mL 0.01 mol/L三氯乙酸除去蛋白質(zhì)，均質(zhì)，以6 000 r/min離心10 min，過濾，再用25 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖溶液提取一次，過濾合并上清液。調(diào)上清液的pH至4.0，加入15 mL乙酸乙酯，6 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)中性快速濾紙過濾到100 mL錐形瓶中。離心管中殘留物用10 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖液重復(fù)提取2次，振蕩10min，在4℃下，以6 000 r/min離心10 min，一并過濾于錐形瓶中［8］。此為備用液，待凈化。

1.3.5樣品的凈化

Oasis HLB固相萃取柱分別用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)處理，保持柱體的濕潤。再用0.1 moL/L Na2EDTAMclivaine緩沖液平衡，取備用液分次全部過同相萃取柱，待液體全部流出后用10 mL 5%甲醇溶液淋柱，在65 kPa減壓抽干30 min。用10 mL 0.01 mol/L草酸甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于錐形瓶中。

1.3.6工作曲線

取7個(gè)編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7的25 mL比色管，分別加入四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL（濃度為0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00mg/L）。用0.01 mol/L草酸溶液定容至刻度。從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，以四環(huán)素的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7樣品的測定

將收集在錐形瓶中的洗脫液，將其進(jìn)行稀釋，使之在曲線濃度范圍內(nèi)，用0.45 μm濾膜過濾，取溶液10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，從工作曲線上查得四環(huán)素濃度，計(jì)算四環(huán)素的含量。

1.3.8結(jié)果計(jì)算

式中：X為試樣中四環(huán)素的含量，（mg/kg）；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試液中四環(huán)素的濃度，（mg/L）；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g。

根據(jù)公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算出測定的濃度，再經(jīng)多次試驗(yàn)計(jì)算出回收率和精密度。

1.3.9豬肉中四環(huán)素殘留的檢測條件的探討

在豬肉中四環(huán)素殘留的檢測條件不同對(duì)高效液相色譜法檢測豬肉中四環(huán)素殘留有一定的影響，本文就對(duì)樣品的提取方法選擇、檢測波長的選擇、提取液的選擇、提取液pH的選擇等進(jìn)行討論。

2　結(jié)果與分析

2.1豬肉中四環(huán)素殘留的檢測結(jié)果與分析

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

按試驗(yàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表1和圖1。

由圖1得，四環(huán)素在0.05 mg/L～2 mg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，測定樣品中四環(huán)素進(jìn)樣量的峰面積為262 822，根據(jù)圖1得樣品中四環(huán)素濃度（Cx）為1.26 mg/L。根據(jù)2.3.8公式計(jì)算樣品中四環(huán)素的含量為0.126 mg/kg。

表1　四環(huán)素的進(jìn)樣量與峰面積Table 1The sample size and peak area of tetracycline

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1Standard diagram

2.1.2精密度試驗(yàn)

分別稱取7份絞碎后的豬肉樣品，在相同的檢測條件下，根據(jù)上述樣品測定方法在同樣的條件下進(jìn)行多次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2　精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of precision test

通過對(duì)同一樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)該測定方法的精密度進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其檢測重復(fù)性好，精密度高，變T（min）、異系數(shù)分別為0.073%，0.83%，因此該精密度符合要求。

2.1.3樣品回收率實(shí)驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行試驗(yàn)。在豬肉樣品中添加一定量的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

由表3可知：豬肉中四環(huán)素的平均回收率為91.1%。符合動(dòng)物性食品中獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范和要求，所以該方法是可行的。

表3　豬肉中四環(huán)素的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3Recovery of tetracycline from pork and the results of the test

2.2提取條件的探討

2.2.1提取液的選擇

稱取同一份豬肉組織5.000 0 g，加入10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，渦旋混勻后，分別加入Na2EDTAMclivaine緩沖液、5%高氯酸溶液、0.01mol/L草酸甲醇溶液3種不同提取液提取，把它們從固相萃取柱上洗脫下來。計(jì)算回收率，四環(huán)素的回收率見表4。

表4　提取液的選擇Table 4Selection of extracts

由表4可見，在相同的條件下，Na2EDTA-Mclivaine緩沖液的提取率高于5%高氯酸溶液和0.01 mol/L草酸甲醇溶液提取液提取率，因此，采用Na2EDTAMclivaine緩沖液作為提取液。

2.2.2提取液pH的選擇

以豬肉為考察對(duì)象，使用3種不同pH（3.0、4.0、5.0）的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表5和圖2。

表5　提取溶液pH對(duì)四環(huán)素提取回收率的影響Table 5The effect of pH value of extraction solution on the recovery of tetracycline

圖2　提取溶液pH的選擇Fig.2The selection of the pH value of the solution

從表5和圖2看出，在相同的條件下，在pH=4.0時(shí)，四環(huán)素回收率達(dá)到最大。故確定用pH=4.0的Na2EDTA-Mclivaine緩沖容液為提取液，溶液中的Na2EDTA能夠掩蔽金屬離子的干擾。

2.3色譜條件的最佳選擇

2.3.1檢測波長的選擇

四環(huán)素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外區(qū)有吸收，四環(huán)素在270 nm附近有較強(qiáng)的吸收，為了確定四環(huán)素的檢測波長，對(duì)其200 nm～450 nm進(jìn)行光譜掃描，四環(huán)素的紫外光譜掃描圖見圖3。

圖3　四環(huán)素紫外-可見光譜圖Fig.3Tetracycline UV Vis

從圖3掃描圖譜可以看出，四環(huán)素在220、235、265nm和355nm處有4個(gè)吸收峰，而在色譜測定中發(fā)現(xiàn)，在265 nm波長處，四環(huán)素的響應(yīng)較大，吸收強(qiáng)度最好，即四環(huán)素的最佳波長為265nm，故本文采用265nm。

2.3.2柱溫的選擇

因?yàn)橹鶞靥?，?dǎo)致四環(huán)素差向異構(gòu)化形成差向四環(huán)素；柱溫太低，導(dǎo)致流動(dòng)相粘度大，造成色譜峰拖尾，當(dāng)柱溫為25、30、35℃時(shí)進(jìn)行色譜測定，結(jié)果見圖4。

圖4　四環(huán)素在不同的柱溫條件下的色譜圖Fig.4The chromatogram of tetracycline under different column temperature conditions

當(dāng)柱溫為40℃時(shí)，四環(huán)素差向異構(gòu)化形成差向四環(huán)素，所以本文不選擇柱溫為40℃。由圖4知：當(dāng)柱溫為35℃時(shí)，四環(huán)素的色譜峰沒有拖尾故，本試驗(yàn)柱溫選擇35℃。

2.3.3流動(dòng)相pH對(duì)分離效果的影響

分別配制pH=7.0，pH=4.0，pH=2.5的乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液的pH，觀察不同的流動(dòng)相對(duì)四環(huán)素和其他雜質(zhì)的分離效果的影響，結(jié)果見表6。

表6　流動(dòng)相pH對(duì)分離效果的影響Table 6The effect of mobile phase pH on separation effect

由表6知，pH=7.0和pH=4.0的情況下，四環(huán)素和其他雜質(zhì)的分離效果不好，色譜柱對(duì)抗生素有較強(qiáng)的吸附作用，因此選擇流動(dòng)相的pH為2.5。

2.3.4流速的選擇

流速大小直接影響色譜柱及其系統(tǒng)壓力、各組分的分離時(shí)間。流速太慢，洗脫時(shí)間太長；流速太快，柱壓太高，容易引起柱頭塌陷，不利于色譜柱的長期使用。在流速分別為：1.0、1.5、2.0 mL/min時(shí)，流速對(duì)四環(huán)素洗脫時(shí)間、柱壓的影響，結(jié)果見表7和圖5，以確定最佳流速。

表7　流速對(duì)四環(huán)素洗脫時(shí)間、柱壓的影響Table 7Effects of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

圖5　流速對(duì)四環(huán)素洗脫時(shí)間、柱壓的影響Fig.5The effect of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

由圖5表明，當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)分離效果最佳。

3　結(jié)論

通過建立了高效液相色譜法（HPLC）檢測豬肉組織中四環(huán)素殘留的方法。最終得出以下結(jié)論：用5%高氯酸溶液25 mL提取樣品中四環(huán)素殘留，經(jīng)0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine緩沖液，0.01 mol/L草酸甲醇溶液凈化。以乙腈0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（30%硝酸溶液調(diào)節(jié)pH2.5）75∶25為流動(dòng)相，色譜柱為ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10 μL，測波長為265 nm，流速為1.0 mL/min。通過實(shí)驗(yàn)可知，本文建立一種方法簡便、快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高的高效液相色譜法，是豬肉中四環(huán)素殘留快速檢測的有效方法。本方法對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，使各色譜峰避免受雜質(zhì)峰的干擾，得到良好的分離，保留時(shí)間穩(wěn)定，線性范圍好，能滿足豬肉中四環(huán)素殘留檢測的分析要求，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

［1］岳振峰，鄭衛(wèi)平，謝麗琪，等.高效液相色譜法測定動(dòng)物組織中四環(huán)素類抗生素殘留量的研究［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2006（10）：24

［2］吉彩霓，岳振峰，謝麗琪，等.高效液相色譜法同時(shí)檢測水產(chǎn)品中7種四環(huán)素類抗生素殘留的研究［A］.中國獸醫(yī)科技，2005，35（10）：820

［3］尹凱丹，張奇志.食品理化分析［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：228-229

［4］丁明潔，張春暉.儀器分析［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：93

［5］中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.116-2003畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測定（高效液相色譜法）［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003，50-229

［6］中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T20764-2006可食動(dòng)物肌肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定（液相色譜-紫外檢測法）［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006：6-22

［7］陳薔.動(dòng)物源食品中四環(huán)素類抗生素殘留高效液相色譜檢測方法的研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009（5）：33

Pork in Tetracycline Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei
（Jiangsu Food Vocational Technical College of Engineering Food and Nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

Based on the high performance liquid chromatography（HPLC）detection of tetracycline residues in pork tissue，and the methods of extraction and determination conditions were discussed.To determine the optimal extraction conditions for 5%perchloric acid solution 25 mL extraction samples tetracycline residues，and the optimal conditions for the determination was a chromatographic column for ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，35℃），column temperature，amount of sample was 10 μL，265 nm wavelength，the flow rate of 1.0 mL/min，the experimental detection of pork samples study on the residues of tetracycline.

high performance liquid chromatography；pork；tetracycline

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.030

2013-12-12

鮑會(huì)梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品理化檢驗(yàn)教學(xué)工作。