rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響研究

許 寧 萬(wàn)英明

（吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 吉林 132013）

rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響研究

許 寧 萬(wàn)英明

（吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 吉林 132013）

目的 研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響。方法 將人牙周膜成纖維細(xì)胞分別放在含有純培養(yǎng)液、含rhIL-1α培養(yǎng)液、含1，25-（OH）2D3培養(yǎng)液和含有rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分別標(biāo)記為D組、A組、B組和C組，培養(yǎng)48 h后，用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果 A組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養(yǎng)基中RANKL上升，但對(duì)RANKL/OPG無(wú)明顯影響。結(jié)論 rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG有較大影響，且rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合使用時(shí)對(duì)RANKL起到了協(xié)同作用。值得臨床進(jìn)一步探究。

rhIL-1α；1，25-（OH）2D3；人牙周膜成纖維細(xì)胞；表達(dá)RANKL和OPG；影響

近年來(lái)，越來(lái)越多的人選擇進(jìn)行固定修復(fù)及牙齒矯正。固定修復(fù)中基牙穩(wěn)定性與牙周膜質(zhì)量密切相關(guān)，而牙齒矯正就需要牙槽骨的改建，此改建過(guò)程極為復(fù)雜，除了成骨、破骨細(xì)胞的參與外，還有許多牙周膜成纖維細(xì)胞也起到了重要作用［1］。人牙周膜成纖維細(xì)胞依靠著表達(dá)RANKL和OPG來(lái)影響骨細(xì)胞的活動(dòng)，二者為破骨細(xì)胞的終末因子，調(diào)控著破骨細(xì)胞的分化、激活和成熟。近期研究發(fā)現(xiàn)rhIL-1α、1，25-（OH）2D3與人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG有一定的關(guān)系。因此，筆者通過(guò)研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的含量調(diào)節(jié)來(lái)為進(jìn)一步進(jìn)行牙齒矯正及固定修復(fù)提供更加合理的方法。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：此次試驗(yàn)所需要的儀器有Trizol試劑（由康為世紀(jì)股份有限公司提供）、氯仿（由淄博卓凱經(jīng)貿(mào)有限公司提供）、乙醇（由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供）、RT-PCR試劑盒（上海譜振生物科技有限公司提供）、SYBR熒光染料（由華美瑞康國(guó)際生物技術(shù)研究中心提供）、DEPC（上海如吉生物科技發(fā)展公司提供）、引物（由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供）、10 μg/L rhIL-1α、1×10-8mol/L 1，25-（OH）2D3等。

1.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：培養(yǎng)材料均來(lái)自于臨床上12歲左右青少年因正畸需要拔除的第一或第二前磨牙，且牙齒無(wú)任何損傷及其他疾病。將牙體放入培養(yǎng)液中，采用組織塊培養(yǎng)法將組織與細(xì)胞分離，培養(yǎng)液每3 d更換一次。取第三代人牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和染色，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將4～7代人牙周膜成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照合適的密度將細(xì)胞培養(yǎng)在65 cm2的培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況。代細(xì)胞完全貼壁后，吸取原有培養(yǎng)液，按分組進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，A組內(nèi)加入rhIL-1α，B組內(nèi)加入1，25-（OH）2D3，C組內(nèi)加入rhIL-1α、1，25-（OH）2D3，D組不加入任何試劑，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-RT-PCR）檢測(cè)RANKLmRNA和OPGmRNA的表達(dá)：①引物合成與設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，由上海英俊公司合成。②細(xì)胞總RNA的提取與檢測(cè)：按照Trizol試劑盒的方法提取總RNA，凝脂糖凝膠電泳觀察RNA質(zhì)量。③cDNA第一條鏈的合成在PCR管中加入RNA模板5 μL、Primer（50 mol/L） oligio（t）1 μL、dNTP Mix（10 mol/L） 1 μL、再加入DEPC水形成10 μL的Mixture1；65 ℃水浴5 min，然后立即放冰2 min；在10 μL的Mixture 1中加入10×RT butter 2 μL、鎂離子（25 mmol/L）4 μL；0.1 mol/L dTT 2 μL、RNaseout （40 U/μL） 1 μL、SuperScrip Ⅲ RT（200 U/μL） 1μL組成20 μL的體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為50 ℃處理50 min，85 ℃處理5 min立即放置到冰上，在每管反應(yīng)體系中加入1 μL的RnaseH 37 ℃處理20 min即獲得cDNA?？梢苑诺?20 ℃冰箱中保存。④熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增技術(shù)中RNAKL反應(yīng)過(guò)程為：95 ℃預(yù)變性2 min→95 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸45 s，共40循環(huán)；OPG反應(yīng)過(guò)程為：95 ℃預(yù)變性2 min→94 ℃變性15 s→60 ℃退火30 s→70 ℃延伸30 s，共40循環(huán)，反應(yīng)后進(jìn)行曲線分析。

表1 擴(kuò)增片段所用引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有差異，P＜0.01有顯著差異，P＞0.05無(wú)差異。

2 結(jié) 果

2.1 48 h后各組RANKL和OPG的比較：經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后可以發(fā)現(xiàn)，D組培養(yǎng)基中無(wú)明顯變化；A組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養(yǎng)基中RANKL上升，但對(duì)RANKL/OPG無(wú)明顯影響。見(jiàn)表2。

表2 四組培養(yǎng)皿中表達(dá)RANKL、OPG和RANKL/OPG的比較

將A、B、C三組與D組進(jìn)行比較，對(duì)比表達(dá)RANKL時(shí)：A組和D組比較t=4.8371，P=0.0008；B組和D組比較t=3.6742，P=0.0010；C組和D組比較t=24.4107，P=0.0000。對(duì)比表達(dá)OPG時(shí)：A組和D組比較t=22.0895，P=0.0000；B組和D組比較t=1.6675，P=0.0032；C組和D組比較t=1.6675，P=0.0153。對(duì)比表達(dá)RANKL/OPG時(shí)：A組和D組比較t=.9954，P=0.0037；B組和D組比較t=29.7945，P=0.0000；C組和D組比較t=1.0547，P=0.3284。

3 討 論

白細(xì)胞介素最初是由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用，所以由此得名，現(xiàn)仍一直沿用。最初是指由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子?，F(xiàn)在是指一類分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能已基本明確、具有重要調(diào)節(jié)作用而統(tǒng)一命名的細(xì)胞因子，它和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。RHIL-1α屬于白細(xì)胞介素-1，其又稱重組人白細(xì)胞介素-1α，是一種具有廣泛生物學(xué)活性的破骨細(xì)胞活化因子，是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)和發(fā)生內(nèi)分泌反應(yīng)的作用，還可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞參與骨吸收活動(dòng)。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)重組人白細(xì)胞介素-1α可以影響成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，本次試驗(yàn)則可以證明重組人白細(xì)胞介素-1α對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG也有顯著效果。它可以將二者同時(shí)上調(diào)。

1，25-（OH）2D3又名1，25二羥基維生素D3。正常情況下，1，25二羥基維生素D3由它的前體25-羥膽固化醇在腎臟合成。人體每日生理合成的1，25二羥基維生素D3為0.5～1.0 μg。在骨形成活躍時(shí)期（例如生長(zhǎng)或妊娠期），其合成量也略有增加。1，25二羥基維生素D3能促進(jìn)腸道對(duì)鈣的吸收，并且調(diào)節(jié)骨質(zhì)的鈣化。對(duì)于嚴(yán)重腎功能衰竭，特別是長(zhǎng)期接受血液透析治療的患者，內(nèi)源性骨化三醇的合成明顯減少甚至完全停止。在研究可以發(fā)現(xiàn)，在1，25二羥基維生素D3培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)RANKL上升，但OPG下降。說(shuō)明這種因素有利于破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)了牙槽骨的吸收。

從本次實(shí)驗(yàn)中可以看出，A組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加（P＜0.05）；B組培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)RANKL上升（P＜0.05），但OPG下降（P＜0.05），RANKL/OPG比值下降（P＜0.05）；C組培養(yǎng)基中RANKL上升（P＜0.05），但對(duì)RANKL/OPG無(wú)明顯影響（P＞0.05）。因此可以看出，重組人白細(xì)胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG有密切的關(guān)系。

目前，重組人白細(xì)胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3是一個(gè)調(diào)節(jié)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的有效預(yù)診手段，且此類檢測(cè)操作方便、成本低廉［5］。通過(guò)試驗(yàn)可以得知重組人白細(xì)胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG有密切的關(guān)系，但二者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)RANKL/OPG既無(wú)明顯增加也無(wú)沒(méi)明顯下降的變化，所以研究具體原因及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

［1］ 張?zhí)m，孫琳琳，丁巖，等.IL-1β對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG、RANKLmRNA表達(dá)的影響［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22（8）: 440-441.

［2］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合作用對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2012，4（28）:316-317.

［3］ 張?zhí)m，孫琳琳，丁巖，等.葡萄糖對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG、RANKLmRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2013，1（22）:71-72.

［4］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.重組人白介素-1α對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG影響的熒光定量RT-PCR研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，26（2）:197-198.

［5］ 于鑫，王月秋，許海平.Toll樣受體2和4在脂多糖誘導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞核因子-B受體活化因子配基中的作用［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，3（30）:325-326.

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1671-8194（2015）13-0088-02