高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量

王慶芬，倪曉霞，李杰，張榮

（中國(guó)人民解放軍第一七五醫(yī)院·廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建漳州363000）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量

王慶芬，倪曉霞，李杰，張榮

（中國(guó)人民解放軍第一七五醫(yī)院·廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建漳州363000）

目的建立同時(shí)測(cè)定枇芩口服液中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫35℃。結(jié)果枇芩口服液中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素達(dá)到了完全分離，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的質(zhì)量濃度線性范圍分別為34.20～171.00μg/mL（r=0.999 8），1.44～7.20μg/mL（r=0.999 6），1.36～6.80μg/mL（r=0.997 7）；高、中、低濃度樣品的平均回收率，黃芩苷分別為99.09%、99.56%和99.61%，黃芩素為98.46%、97.95%、98.31%，漢黃芩素為98.44%、98.51%和98.10%（n=9）。結(jié)論該法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于枇芩口服液的質(zhì)量控制。

枇芩口服液；高效液相色譜法；黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素

枇芩口服液是我院皮膚科依據(jù)中醫(yī)辨證理論，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)研制的治療痤瘡的中藥復(fù)方制劑，由枇杷葉、黃芩、白花蛇舌草等13味中藥組方，適用于先天腎陰不足、腎火過(guò)旺，加之飲食失節(jié)而發(fā)病的痤瘡患者［1］。處方中黃芩為君藥，黃芩活性成分主要為黃酮類化合物，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在醫(yī)藥和很多領(lǐng)域有著廣泛的用途，試驗(yàn)證明，黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等抑菌活性好［2］。因此，對(duì)黃芩中的主要活性成分進(jìn)行含量控制，對(duì)于該制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。枇芩口服液在我院使用多年，臨床效果較好，由于成分復(fù)雜，一直以來(lái)缺少質(zhì)量控制方法?，F(xiàn)建立了同時(shí)測(cè)定枇芩口服液中君藥黃芩所含黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法［3］，以多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量，旨在為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器和試藥

Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀，QUAT Pump G1311A型二極管陣列檢測(cè)器，ChemState 320型數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；AUX220型電子分析天平（日本島津）；一次性針頭過(guò)濾器；U-S15型實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)。甲醇（HPLC/spectro，TEDIA公司，Lot909910）；磷酸（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)為20041001）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-201318），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595-200905），漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111514-200403），均由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供，枇芩口服液（本院制劑室配制，批號(hào)為20140509，20140519，20140521）。

2　方法和結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min，47%甲醇；20～30min，47%～53%甲醇；30～40 min，53%～60%甲醇；40～50 min，60%～53%甲醇；50～55 min，53%～47%甲醇；55～60 min，47%甲醇）；流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。在上述色譜條件下，分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，過(guò)濾，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素與其他組分均能達(dá)到較好的分離，且分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。

圖1　枇芩口服液高效液相色譜圖

2.2溶液制備

分別精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品17.1，1.2，3.4mg，置50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為342.00，24.00，68.00μg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品貯備液5mL、黃芩素對(duì)照品貯備液3mL、漢黃芩素對(duì)照品貯備液1mL，分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得混合對(duì)照品溶液。取枇芩口服液適量，用水稀釋5倍，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。根據(jù)枇芩口服液處方，制備缺黃芩陰性樣品，用水稀釋5倍，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取黃芩苷對(duì)照品貯備液5mL、黃芩素對(duì)照品貯備液3mL、漢黃芩素對(duì)照品貯備液1mL，分別置10，15，20，25，50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別依次注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為10μL，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品貯備液5mL、黃芩素對(duì)照品貯備液3mL、漢黃芩素對(duì)照品貯備液1mL，分別置25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定峰面積，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.07%，0.54%，0.29%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為20140509），分別在0，3，6，9，12 h時(shí)進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.67%，1.18%，1.58%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品溶液（批號(hào)為20140509）5份，分別依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.34%，1.28%，1.17%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的供試品溶液（批號(hào)為20140509，樣品含黃芩苷319.1885μg/mL、黃芩素19.8815μg/mL、漢黃芩素9.901 0μg/mL）2 mL，分別加入黃芩苷對(duì)照品液（171.00μg/mL）、黃芩素對(duì)照品液（6.00μg/mL）和漢黃芩素對(duì)照品液（6.80μg/mL）1.0，1.5，2.0mL，用水定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4樣品含量測(cè)定

取3批枇芩口服液，依法制備供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3　討論

進(jìn)行多種流動(dòng)相試驗(yàn)，參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》［4］，以甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）為流動(dòng)相，因其中磷酸可作為解離抑制劑，抑制組分解離，增強(qiáng)保留［5］，進(jìn)而采用梯度洗脫的方法［6-9］，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和干擾雜質(zhì)分離良好，且出峰時(shí)間比較早。預(yù)試驗(yàn)中曾對(duì)比甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）等度洗脫和梯度洗脫，采用等度洗脫方法時(shí)，黃芩素出峰時(shí)間約在47min，漢黃芩素出峰時(shí)間在60min后，分離時(shí)間長(zhǎng)，分離效果不理想。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL）

目前，2010年版《中國(guó)藥典（一部）》及相關(guān)文獻(xiàn)僅對(duì)黃芩中黃芩苷的含量進(jìn)行控制，單以黃芩苷來(lái)衡量黃芩的質(zhì)量稍顯片面性。研究證明，黃芩苷口服液不易吸收，須在腸道經(jīng)酶水解為苷元黃芩素后方可吸收入血，黃芩素是體內(nèi)重要有效成分［10］。本試驗(yàn)中建立了同時(shí)測(cè)定枇芩口服液中3種指標(biāo)成分的HPLC法，該法科學(xué)、合理，能相對(duì)較客觀、全面地反映枇芩口服液的內(nèi)在質(zhì)量，為客觀評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

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Simultaneous Determ ination of Baicalin，Baicalein and Wogonin in Piqin Oral Solution by HPLC

Wang Qingfen，Ni Xiaoxia，Li Jie，Zhang Rong
（Department of Pharmacy，175 Hospital of PLA/the Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University，Zhangzhou，F(xiàn)ujian，China 363000）

Objective To establish a method for the simultaneous determination of baicalin,baicalein and bogonin in Piqin Oral Solution by HPLC.M ethods The Kromasil-C18column（250 mm×4.6 mm,5μm）with a column temperature of 35℃was used；the mobile phase consisted of methanol-0.2%phosphate,gradient elution,with flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelength was set at 280 nm.Results The content of baicalin,baicalein and wogonin achieved a complete separation,peak area of the 3 components had a good linear relationship with the amount of samples.The linear ranges of baicalin,baicalein and wogonin were 34.20-171.00μg/mL（r=0.999 8）,1.44-7.20μg/mL（r=0.999 6）,1.36-6.80μg/mL（r=0.997 7）respectively；the sample-adding recovery were 99.09%,99.56%,99.61%for baicalin，98.46%,97.95%,98.31%for baicalein，and 98.44,98.51,98.10%for wogonin in high，middle，low concentrations（n=9）.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and reproducible,and it is suitable for the content determination of baicalin,baicalein and wogonin in Piqin Oral Solution.

Piqin Oral Solution；HPLC；baicalin；baicalein；wogonin

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0093-03

王慶芬，女，主管藥師，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑，（電子信箱）wqf0596@163.com；張榮，副主任藥師，研究方向?yàn)樗帉W(xué)管理、醫(yī)院制劑，本文通訊作者，（電話）0596-2975701。

2014-07-28）