多指標正交試驗法優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝*

李衛(wèi)平，鄒龍，王連平，劉紅宇

（1.岳陽職業(yè)技術學院，湖南岳陽414000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410208）

多指標正交試驗法優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝*

李衛(wèi)平1，鄒龍2，王連平2，劉紅宇3

（1.岳陽職業(yè)技術學院，湖南岳陽414000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410208）

目的優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝。方法以馬錢苷、丹酚酸B的含量及浸膏得率為綜合評價指標，采用L9（34）正交試驗設計，考察加水量、提取時間、提取次數3個因素對提取工藝的影響。結果最佳提取工藝為加（10，10，10）倍量水，提取3次，每次提取時間為90min。結論優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定、可行。

正交試驗法；滋陰明目片；提取工藝

滋陰明目丸由黃精、山茱萸、熟地、牡丹皮、丹參、淮山、菟絲子、牛膝、當歸、石決明、三七、枸杞、茯苓、羌活、川芎、石菖蒲、楮實子17味中藥組方，具有滋陰、活血、利水的功效，對原發(fā)性視網膜色素變性、視神經萎縮、黃斑變性等難治性眼疾療效顯著。擬將滋陰明目丸劑型改為片劑，以更好地適應患者需求［1-3］。現采用正交試驗設計法，以馬錢苷、丹酚酸B的含量和浸膏得率為考察指標優(yōu)選提取工藝，為片劑標準化生產提供試驗依據。

1　儀器與試藥

FE102型微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHG101型電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠）；TP214型分析天平（南京庚辰科學儀器有限公司）；Agilent1100型高效液相色譜系統（安捷倫科技有限公司）；AR2140型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。丹酚酸B對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為MUST-12020104，純度≥98%）；馬錢苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為111640-200604，純度≥98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。山茱萸、黃精等17味藥材均購于長沙醫(yī)藥公司，由湖南中醫(yī)藥大學鄒龍教授鑒定，符合2010年版《中國藥典（一部）》規(guī)定。

2　方法與結果

2.1丹酚酸B與馬錢苷含量測定［4-7］

2.1.1色譜條件與系統適用性試驗

丹酚酸B：色譜柱為KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-乙腈-1.67%甲酸水（24∶10∶66）；檢測波長為286 nm；流速為1.0mL/min。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于2 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1　丹酚酸高效液相色譜圖

馬錢苷：色譜柱為KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為水-乙腈（90∶10）；柱溫為25℃；流速為1.0mL/min；進樣量為10μL。理論板數按馬錢苷峰計算應不低于3 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖2。

2.1.2溶液制備

圖2　馬錢苷高效液相色譜圖

分別精密稱取干燥至恒重的對照品丹酚酸B 0.006 0 g和馬錢苷0.004 2 g，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解、定容，分別制得0.12 g/L的丹酚酸B對照品溶液和0.084 g/L的馬錢苷對照品溶液［8］。稱取浸膏粉適量，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50mL，稱重，超聲溶解后再次稱重，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。分別取缺丹參的其余藥味、缺山茱萸的其余藥味，按正交試驗的優(yōu)化工藝分別制成缺丹參和缺山茱萸的陰性樣品，按對照品溶液制備方法制備陰性對照品溶液［9］。

2.1.3方法學考察

陰性干擾試驗：取缺丹參的陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液在丹酚酸B對應色譜峰（主峰保留時間為11.73min）處無相應峰出現，表明方中其他藥味對丹酚酸B的測定無干擾。取缺山茱萸的陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液在馬錢苷對應色譜峰（主峰保留時間為19.74min）處無相應峰出現，表明方中其他藥味對馬錢苷的測定無干擾。

線性關系考察：精密吸取丹酚酸B對照品溶液，分別進樣2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μL，測定峰面積，以峰面積（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=1 035.6 X-20.733，r=0.999 9（n=5）。結果表明，丹酚酸B進樣量在0.24～1.20μg范圍內與峰面積線性關系良好。精密吸取0.084g/L馬錢苷對照品溶液4，6，8，10，20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=2 117.5X-10.638，r=0.999 5（n=5）。結果表明，馬錢苷進樣量在0.336～1.68μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6次。結果的RSD為1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取批號為20121022的樣品，平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定。結果丹酚酸B含量的RSD為1.56%（n=6），馬錢苷含量的RSD為1.66%（n=6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取批號為20121022的樣品6份，加入丹酚酸B對照品適量，依法測定并計算回收率。結果平均回收率為98.90%，RSD為1.16%（n=6）；精密稱取批號為20120922樣品6份，加入馬錢苷對照品適量，依法測定并計算回收率。結果平均回收率為99.55%，RSD為0.71%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，3，6，12 h時進樣測定。結果丹酚酸B、馬錢苷峰面積的RSD分別為1.88%和1.46%（n=5），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2浸膏得率測定

按處方比例稱取藥材9份，每份17味藥材，單劑合計135 g，用水回流提取，合并提取液，離心抽濾，濃縮，85%乙醇醇沉，過濾，濃縮干燥，在65℃真空干燥箱中干燥，稱重，計算浸膏得率。2.3正交試驗設計

經預試驗摸索得知，加水量、提取時間、提取次數對產品收率影響大，選取加水量（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）為考察因素，每個因素設計3個水平，采用L9（34）正交表對工藝進行考察。因素水平表見表1。

根據組方藥材有效部位（成分）主要以水溶性為主，故將方中藥材用水回流提取，醇沉，濃縮干燥成浸膏，測定浸膏中丹酚酸B、馬錢苷的含量，采用加權綜合評分法優(yōu)選最佳提取工藝［10-11］。

從100mL提取液中精密移取適量，過0.45μm微孔濾膜，置入高效液相色譜系統，依法測定，記錄峰面積，測定丹酚酸B和馬錢苷的含量，并計算丹酚酸B和馬錢苷的提取率，結果見表2。對加權分析的結果采用SPSS 16.0軟件進行方差分析，結果見表3。

由表2可見，R值反映加水量、提取時間、提取次數3因素的主次位置為C＞B＞A，即提取次數＞提取時間＞加水量。表3中的加權結果顯示，PC＜0.05，PA，PB＞0.05，只有提取次數（C）有統計學意義。根據表2中浸膏得率、丹酚酸B提取率、馬錢苷提取率及綜合評分4項指標的K值大小，得知A2B3C3為最佳工藝條件，即加10倍量水、提取3次、每次90min。

2.4驗證試驗

按處方比例稱取藥材3份，以A2B3C3為條件，平行試驗3次，分別測定浸膏得率、丹酚酸B和馬錢苷提取率，加權統計結果見表4。結果表明，浸膏得率、丹酚酸B提取率、馬錢苷提取率3次試驗結果穩(wěn)定且綜合評分較高，與正交試驗結果一致，正交優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定。

表1　因素水平表

3　討論

滋陰明目丸使用已達20余年，針對視神經萎縮、黃斑變性等多種難治目疾療效確切，安全可靠，值得深入研究。本試驗運用多指標正交設計法，采用2010年版《中國藥典（一部）》馬錢苷、丹酚酸B的含量測定方法優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝。結果表明，該方法簡便快速，基線基本分離，雜質對標準品峰無干擾，可作為滋陰明目片提取工藝質量控制的指標。試驗優(yōu)選的最佳工藝條件為，加10倍量水，每次90min，提取3次。

表2　L9（34）正交試驗設計與結果（n=3）

表3　加權綜合分數方差分析表

表4　驗證試驗結果

［1］龐惠萍，李起家，干性年齡相關性黃斑變性的治療時機探討［J］.中國保健營養(yǎng)，2012，26（10）：127.

［2］劉志恒，炎癥與年齡相關性黃斑變性［J］.臨床眼科雜志，2012，20（3）：182.

［3］李波，張波濤，李傳課，等，滋陰明目丸治療濕性老年性黃斑變性的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2007，17（6）：311-312.

［4］楊小寧，唐星，柳玉石，等.丹參中總酚酸的分離純化工藝研究［J］.中草藥，2007，38（6）：843-846.

［5］謝靜，丹參水溶性成分提取工藝研究［J］.中國藥業(yè)，2009，18（3）：27-28.

［6］梁晉如，何姣，朱砂，等.山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的藥理作用及提取分離方法研究進展［J］.中國藥理通訊，2011，29（4）：29.

［7］張燕，宋鵬飛.HPLC法測定清眩糖漿中馬錢苷的含量［J］.解放軍藥學學報，2012，28（4）：353-354.

［8］朱砂，梁晉如，何姣，等.HPLC法同時測定不同產地及不同采收時間山茱萸中三個環(huán)烯醚萜苷的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（7）：1 235-1 238.

［9］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：26.

［10］郝延軍，趙曉笠，桑育黎，等，六味地黃丸對照提取液的實驗研究［J］.中草藥，2013，44（2）：180-182.

［11］賀娟妮，劉曉，牟朝麗，等.山茱萸中3種環(huán)烯醚萜苷的響應曲面優(yōu)化微波提取及HPLC測定［J］.中藥材，2011，34（7）：1 118-1 122.

Optim ization of Ziyinm ingmu Tablets Extraction Process by M ulti-Index Orthogonal Experiment

Li Weiping1，Zou Long2，Wang Lianping2，Liu Hongyu3
（1.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang，Hunan，China 414000；2.Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，
China 410208；3.First Hospital of Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，China 410208）

Objective To optimize the extract process of Ziyinmingmu Tablets.M ethod With the content and extraction rate of the loganin and salvianolic acid B as the comprehensive evaluation index，The orthogonal test of L9（34）was adopted to inspect the influence of volume of water，extract time and extract frequency on the extraction process.Result The best extraction process was adding（10，10，10）times amount water，and extracting 3 times with 90 minutes each time.Conclusion The optimal extraction process is stable and feasible.

orthogonal experiment；Ziyinmingmu Tablets；extraction process

TQ461；R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0016-04

李衛(wèi)平（1975-），女，碩士研究生，副教授，研究方向為中藥新制劑工藝與質量標準，（電子信箱）1307878066@ qq.com；劉紅宇，碩士研究生，副主任藥師，研究方向為中藥新制劑工藝與質量標準，本文通訊作者，（電子信箱）lhy9544@ 163.com。

2014-05-28；

2014-11-12）

*湖南省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目，項目編號：201124。