天冬總皂苷的超聲提取工藝優(yōu)化

劉　亮，丁麗娜，陳東林，馮　華，周英信

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州，遵義 563002； 2.遵義市藥品檢驗所，貴州，遵義　563000）

天冬總皂苷的超聲提取工藝優(yōu)化

*劉亮1，丁麗娜1，陳東林1，馮華2，周英信1

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州，遵義 563002； 2.遵義市藥品檢驗所，貴州，遵義563000）

目的探討天冬總皂苷含量的測定方法，優(yōu)化超聲提取工藝。方法以菝葜皂苷元為對照品，采用紫外分光光度法測定總皂苷的含量，用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化超聲提取工藝。結(jié)果菝葜皂苷元質(zhì)量濃度在5.2～52 μg/mL之間線性關(guān)系良好（r = 0.9994），總皂苷平均回收率達到98.83%（RSD = 1.88%）。最佳超聲提取工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間20 min。結(jié)論總皂苷含量測定方法簡單、易行、準確，超聲提取工藝高效、快捷，易于推廣。

天冬；總皂苷；超聲提取

天冬為百合科植物天門冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的塊根，是一種臨床常用中藥，具有養(yǎng)陰清熱，潤肺滋腎的功效，臨床上多用于治陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥。通過文獻查閱，筆者發(fā)現(xiàn)天冬中含有多種甾體皂苷類、糖類、氨基酸類、還含有甾醇類、強心苷類及豐富的維生素等成分［1-2］，其中甾體皂苷是天冬中所含有的一類重要活性成分，該類成分的藥理學研究目前主要有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗血小板凝聚等方面［3-4］。目前對其多糖、氨基酸提取工藝方面研究較少［5-6］，對皂苷提取工藝研究更少［7］，難以進行深入開發(fā)。本實驗以總皂苷含量為指標，對天冬超聲提取工藝進行優(yōu)化，以期為制定天冬藥材質(zhì)量標準和進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

天冬藥材采集于貴州遵義，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W校張學愈副教授鑒定為百合科植物天門冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的塊根；菝葜皂苷元對照品購于上海圻明生物科技有限公司（批號：126-19-2）；所用水為高純水，其它試劑均為分析純。

JBT/C-YCL400T/3P（D） 型超聲波藥品處理機（濟寧金百特工程機械有限公司）；Aquelix 5型實驗室高純水系統(tǒng)（重慶市金富科技發(fā)展有限公司）；UV2501紫外分光光度計（日本島津公司）；Senco R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；FY130型藥物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004B型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1天冬總皂苷的含量測定

1.2.1.1供試品溶液的制備

稱取天冬藥材粗粉5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，超聲提?。?8 kHz，150 W），過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻。準確吸取10 mL于分液漏斗中，用水飽合正丁醇分3次萃取，每次15 mL，正丁醇萃取液再用正丁醇飽和的水20 mL萃取后，減壓回收正丁醇至干，殘渣用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.1.2對照品溶液的制備

精密稱取菝葜皂苷元對照品7.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.2.1.3測定波長的確定

分別精密吸取對照品溶液0.3 mL、供試品溶液1.2 mL置于15 mL具塞試管中，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60 ℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min，在400～800 nm進行掃描，選擇最大吸收波長為測定波長［8］。

1.2.1.4標準曲線的繪制

分別精密移取菝葜皂苷元對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于15 mL具塞試管內(nèi)，揮干甲醇，按1.2.1.3項下的操作方法顯色，于455 nm處測定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 超聲提取單因素實驗設(shè)計

影響天冬皂苷超聲提取的因素很多，如提取功率、提取溫度、提取時間、溶劑濃度、溶劑倍量等。在查閱文獻［9-14］的基礎(chǔ)上，本實驗以乙醇作為提取溶劑，選取乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%） 、料液比（ 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL） 、提取溫度（ 30、40、50、60、70、80℃）和提取時間（ 10、20、30、40、50、60 min） 4因素6水平進行實驗，考察不同因素對天冬皂苷提取含量的影響，并篩選各因素的3個最佳水平。

1.2.3超聲提取正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，稱取天冬藥材粗粉，按L9（34）正交因素水平表進行實驗（表1），以優(yōu)化天冬皂苷的提取條件。應(yīng)用最佳的超聲提取工藝測定天冬中的皂苷，重復(fù)3次，以驗證本工藝的準確性。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　The factors and levels for the orthogonal design

2　結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定

2.1.1測定波長

掃描圖譜顯示對照品在455 nm處有較大吸收峰（圖1），而樣品在455 nm處有最大吸收峰（圖2），故選擇455 nm為測定波長。

圖1　對照品溶液吸收曲線Fig.1　Absorption curve of standard solution

圖2　供試品溶液吸收曲線Fig.2　Absorption curve of test solution

2.1.2 標準曲線的繪制

由標準曲線（圖3）計算出回歸曲線方程為A = 0.01169C+0.03056，r = 0.9994。表明對照品菝葜皂苷元質(zhì)量濃度在5.2～52 μg/mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖3　菝葜皂苷元的標準曲線Fig.3　Standard curve of sarsasapogenin

2.1.3總皂苷含量測定方法學考察

2.1.3.1精密度實驗

精密吸取對照液0.8 mL，共6份，按1.2.1.3項下的操作方法顯色，于455 nm處測定吸光度，結(jié)果RSD為0.50%，表明方法的精密度良好。

2.1.3.2穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取對照品溶液0.3 mL、供試品溶液0.6 mL，按1.2.1.3項下的操作方法顯色，于455 nm處分別在0、10、20、30、60、90、120 min測定吸光度，結(jié)果表明對照液及供試液顯色后在120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為1.02%，1.42%。

2.1.3.3重復(fù)性實驗

精密稱取同一批樣品5 g，共6份，按1.2.1.1及1.2.1.3項下的操作方法顯色，于455 nm處測定吸光度，并計算含量，結(jié)果平均含量為0.90 %，RSD為0.73 %，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.3.4加標回收率實驗

精密吸取已知含量的樣品溶液0.6 mL于具塞試管中，共6份，分別加入對照品溶液0.3 mL，按1.2.1.3項下的操作方法顯色，于455 nm處測定吸光度，計算加標回收率。結(jié)果總皂苷平均回收率為98.83%，RSD為1.88%。

2.2超聲提取單因素實驗結(jié)果

2.2.1乙醇濃度的影響

由圖4可知（提取溫度60℃、時間30 min、料液比1:20），乙醇濃度在40%～90% 范圍內(nèi)，天冬皂苷的提取量隨乙醇濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。根據(jù)相似相容原理，隨著乙醇濃度的增加，當其極性越接近于天冬皂苷的極性時，有利于提取，當乙醇濃度增加到50 % 時，皂苷提取量即達到最高。其中以40%～60% 的乙醇溶液提取的皂苷含量相對較高，因此選擇乙醇濃度40 %、50 %、60 %作為正交實驗的3水平。

2.2.2料液比的影響

圖4　乙醇濃度對總皂苷含量的影響Fig.4　Effect of ethanol concentration on the extraction of total saponins

由圖5可知（提取溫度60 ℃、時間30 min、乙醇濃度50 %），當料液比為1:15（g/mL）以上后總皂苷提取量基本無變化，說明提取已達到平衡狀態(tài)。從提取率和成本等方面考慮，乙醇的用量不宜過大，因此選取料液比為1:10、1:15、1:20（g/mL）作為正交實驗的3水平。

圖5　料液比對總皂苷含量的影響Fig.5　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction of total saponins

2.2.3 提取溫度的影響

由圖6可知（提取時間30 min、料液比1:15、乙醇濃度50%），提取溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)，皂苷提取量隨溫度的升高而明顯增加；在50～80 ℃范圍內(nèi)，皂苷提取量逐漸下降，說明溫度過低或過高均不利用皂苷的提取。因此選擇40 ℃、50 ℃、60 ℃作為正交實驗的3水平。

圖6　提取溫度對總皂苷含量的影響Fig.6　Effect of temperature on extraction content of total saponins

2.2.4 提取時間的影響

由圖7可知（提取溫度50 ℃、料液比1:15、乙醇濃度50%），在15～20 min范圍內(nèi)，皂苷提取量隨時間的延長而顯著增加；當提取時間超過20 min之后，提取含量極緩慢下降，說明提取已達到平衡狀態(tài)。因此選擇10、20、30 min作為正交實驗的3水平。

圖7　提取時間對總皂苷含量的影響Fig.7　Effect of time on extraction content of total saponins

2.3 超聲提取正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，可以基本確定天冬皂苷超聲提取時乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度的合理范圍，在此基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗，以確定其超聲提取的最佳工藝。正交實驗結(jié)果及分析見表2和表3。

表2　正交實驗結(jié)果Table 2　Results of reciprocal orthogonal test

表3　方差分析Table 3　Variance analyses

由表2 、表3 可見，乙醇濃度對實驗結(jié)果具有顯著性影響（P ＜ 0.05），影響因素主次順序為D ＞B ＞ C ＞ A，最優(yōu)工藝為A3B2C3D2，即超聲提取的最佳工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間20 min。按照正交實驗得出的最佳提取工藝做3次重復(fù)實驗，天冬總皂苷含量平均值為0.94 %，RSD 為0.52 %。

3　討論

皂苷分子結(jié)構(gòu)中無共軛雙鍵，在紫外可見光區(qū)無特征性吸收峰，可以利用顯色反應(yīng)后在可見光范圍產(chǎn)生特征性吸收峰。根據(jù)前期文獻的研究，結(jié)合紫外法的顯色特點，實驗以菝葜皂苷元為對照品，采用香草醛-高氯酸法顯色，對天冬中總皂苷的含量測定進行了方法學考察，顯色過程中應(yīng)嚴格控制溫度和時間。

超聲提取方法的原理是利用超聲波的機械作用、空化作用等達到植物細胞的破碎，加速有效成分的溶出、擴散，具有省時、節(jié)能、操作簡便等優(yōu)點。從理論上考慮，提取時間越長、溫度越高，總皂苷得率應(yīng)越高，但單因素實驗結(jié)果不支持該觀點，可能是因為提取時間過長、溫度過高、超聲強化作用增加了雜質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致總皂苷溶解量減少?？傇碥盏募兓壤闷湓诤〈贾腥芙舛容^大的性質(zhì)進行萃取，進而用水萃取除去水溶性的雜質(zhì)，可以得到純化的總皂苷。由于皂苷具有很強的發(fā)泡性，故在濃縮過程中應(yīng)時刻注意，避免濃縮液沖出，影響實驗結(jié)果的準確性。本實驗通過單因素實驗及正交實驗優(yōu)選天冬超聲提取工藝，單因素實驗分別考察了乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對皂苷提取效果的影響，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇4因素3水平進行正交實驗，研究結(jié)果表明只有乙醇濃度對總皂苷的含量有顯著性影響，影響因素主次順序為D ＞ B ＞ C ＞ A，最佳工藝為A3B2C3D2，即超聲提取的最佳工藝為乙醇濃度50%、料液比1:20（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取時間20 min。實驗之初對天冬總皂苷回流提取法進行了研究，回流提取工藝為提取時間1.5 h、乙醇倍數(shù)8倍、乙醇濃度70%、提取次數(shù)3次，含量可達到1.12%，略高于超聲法，但超聲法提取快速高效的優(yōu)勢是回流法無法比擬的。依照超聲法最佳提取工藝做3次重復(fù)實驗，天冬總皂苷提取含量平均值0.94 %（已對此數(shù)據(jù)進行核實，確為天冬總皂苷的含量，與參考文獻7比較要低些，但顯色方法及測量波長不一樣，所以總皂苷的含量就不一樣），RSD為0.52 %。驗證實驗證實，優(yōu)化后的工藝路線穩(wěn)定可行，操作簡便，節(jié)省時間和溶劑，可為天冬的生產(chǎn)應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)和參考。

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ULTRASONIC EXTRACTION OPTIMIZATION OF TOTAL SAPONINS FROM ASPARAGUS COCHINCHINENSIS （LOUR.） MERR.

*LIU Liang1， DING Li-na1， CHEN Dong-lin1， FENG Hua2， ZHOU Ying-xin1

（1.Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563002， China；2.Zunyi Institute for Drug Control， Zunyi， Guizhou 563000， China）

Objective: To develop a method for determining the content of total saponins in Asparagus cochinchinensis and optimize its ultrasonic extraction process.Methods: Sarsasapogenin as the control sample，the content of total saponins was determined by ultraviolet spectrophotometry.Optimization of the ultrasonic extraction process of total saponins was performed using single factor and orthogonal array design methods.Results: The calibration curve of the sarsasapogenin was linear （r = 0.9994） in the range of 5.2～52 μg/mL with average spike recovery of 98.83% （RSD = 1.88%）.The optimum ultrasonic extraction conditions were found to be: ethanol concentration of 50%， solid-to-liquid ratio of 1:20， extraction temperature of 60℃， ultrasonic extraction duration of 20 minutes.Conclusion: The developed method for total saponins determination is simple， feasible and accurate.The optimized extraction process is efficient and quick， and easy to popularize.

Asparagus cochinchinensis； total saponins； ultrasonic extraction

R284.2

ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2015.02.020

1674-8085（2015）02-0081-06

2015-01-09；修改日期：2015-03-01

遵義市科技局、遵義醫(yī)藥高等?？茖W校聯(lián)合科技計劃項目（遵市科合社字【2013】24號）；遵義市匯川區(qū)科技計劃項目。作者簡介：*劉亮（1981-），男，重慶萬州人，副教授，主要從事中藥、民族藥化學成分及質(zhì)量研究（E-mail:jikman1@163.com）；

丁麗娜（1981-），女，貴州遵義人，講師，主要從事天然藥物化學成分及質(zhì)量研究（E-mail:lifewaterdln0681@qq.com）；

陳東林（1961-），女，貴州遵義人，教授，主要從事蔬菜化肥、農(nóng)藥含量（E-mail:1064618089@qq.com）；

馮華（1978-），男，貴州遵義人，主管藥師，主要從事新藥研究及藥品檢驗（E-mail:fenghua781014@yahoo.com.cn）；

周英信（1962-），男，貴州遵義人，教授，主要從事脾胃病證治研究（E-mail:E-mail:1487476788@qq.com）.