黃連、五味子醇提物對(duì)獼猴桃潰瘍菌的抑制作用

汪輝煌，崔國庭

（1.黃山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 黃山245000；2.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽471003）

潰瘍菌是引起獼猴桃潰瘍病的主要病原菌，由潰瘍菌引發(fā)的潰瘍病成為獼猴桃的主要病害之一。病害發(fā)生時(shí)，獼猴桃樹整株枯死，造成果園毀滅，顆粒無收，產(chǎn)量與品質(zhì)嚴(yán)重受損[1]。含銅殺菌劑、鏈霉素等最初作為抑制潰瘍菌有效的藥物，隨著抗銅離子、抗鏈霉素菌株的出現(xiàn)，這些殺菌劑抗菌效果不斷的減弱[2]。尋找到新的有效抑制潰瘍菌的殺菌劑成為目前獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迫切需求。

黃連、五味子是我國的傳統(tǒng)中藥，該藥安全性高、副作用小、成本低、抗菌范圍廣、且具有抗病毒作用，在我國被廣泛應(yīng)用[3-4]。近年來，大量的研究顯示，黃連、五味子對(duì)多種革蘭氏陽性和陰性菌均有抑制作用[5-7]。目前，有關(guān)黃連、五味子醇提物對(duì)于獼猴桃潰瘍菌的抑制作用與機(jī)理的研究鮮見報(bào)道，本文就這方面的進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

供試菌種：獼猴桃潰瘍菌；

黃連、丁香、五味子、蒼術(shù)、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉。

試劑：無水乙醇（分析純）。

1.2 主要儀器：

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空凍干機(jī)，恒溫干燥箱，超聲波清洗器，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，冰箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃連、五味子等中藥提取物的制備

黃連、五味子等中藥經(jīng)50℃干燥后粉碎，過60目篩，取100g，用70%乙醇以料液比為1：10在50℃條件下水浴浸提8h，浸提兩次，合并提取液、用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至膏狀、真空凍干機(jī)中干燥、粉碎即得中藥乙醇粗提取物，取4mg溶于1mL70%乙醇中，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基及潰瘍菌懸液的制備[8]

KB培養(yǎng)基的制備：1L水中加入20g蛋白胨、1.5g硫酸鎂、1.5g磷酸氫二鉀、17g瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌30min，趁熱在超凈工作臺(tái)上倒入無菌平皿，備用。

菌懸液的制備：挑選長勢較好的潰瘍菌接入不含瓊脂的KB液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)16-24h，活化潰瘍菌繁殖，當(dāng)菌液由透明變黃色混濁時(shí)終止培養(yǎng)，低溫保藏備用。

制備抑菌濾紙片：取普通的定量濾紙，使用打孔器做成直徑為6mm圓片，置于潔凈干燥燒杯內(nèi)干熱滅菌（120℃，2h）后，分別浸于黃連、五味子、丁香、蒼術(shù)、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉等不同濃度的藥液中24h，取出晾干備用。

抑菌實(shí)驗(yàn)(瓊脂平板擴(kuò)散法)：取平皿，倒入培養(yǎng)基、冷卻后，在培養(yǎng)基上均勻涂布一層稀釋的試驗(yàn)菌，試驗(yàn)菌用量以對(duì)照平皿表面菌生長能呈半密集菌落為定。然后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中5min，使其表面干燥，將抑菌濾紙片按標(biāo)號(hào)依次貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好。倒置培養(yǎng)（30℃）12h后，取出平皿，觀察抑菌圈大小并測定其直徑。

1.3.3 中藥的抑菌作用

取一定質(zhì)量的黃連、丁香、五味子、蒼術(shù)、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉提取物，加乙醇配制成相同濃度的溶液，采用瓊脂平板擴(kuò)散法測定其抑菌作用，以抑菌環(huán)直徑（cm）表示：抑菌環(huán)直徑=抑菌圈直徑（cm）-濾紙片直徑（cm）。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）[9]

最低抑菌濃度是指在體外能夠抑制細(xì)菌生長的最低濃度。采用肉湯培養(yǎng)基測定方法。稱取少量干燥后的黃連、五味子提取物，用乙醇配制成一定濃度為的溶液，加入96孔板，并逐倍稀釋，加入菌懸液，使菌懸液最終OD值達(dá)到0.030左右，黃連、五味子提取物最終濃度達(dá)到0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024mg/mL。 并設(shè)空白與對(duì)照組，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h，檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 黃連、五味子提取物對(duì)潰瘍菌生長抑制[10-11]

活化潰瘍菌，將其接種于肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12h，加入黃連、五味子提取物28℃條件下，過一段時(shí)間取培養(yǎng)液進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，與未加黃連、五味子提取物的菌液對(duì)比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 潰瘍菌培養(yǎng)液中可溶性總糖的測定[12]

活化潰瘍菌，28℃，100r/min振蕩培養(yǎng)12h，取適量菌液，加入黃連、五味子提取物，使其最終濃度達(dá)到64μg/mL， 分別于28℃，100r/min培養(yǎng)0h、1h、2h、4h、6h、8h后取出，4000r/min離心20min， 取上清液200μL，加水稀釋至1.0mL，加入蒽酮試劑4.0mL，冷卻5min，沸水浴10min，室溫冷卻10min，于620nm處測定OD值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以無菌水代替黃連、五味子提取物作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 提取物對(duì)菌體磷代謝的影響[12]

根據(jù)翟培等的方法[13]，將活化的獼猴桃潰瘍菌轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)肉湯中，恒溫條件下培養(yǎng)（28℃，12h），然后以4000r/min離心20min，棄上清液，菌體用pH 7.4的磷酸緩沖液（0.1mol/L）稀釋為106CFU/mL的菌液；取菌液和葡萄糖溶液各0.5mL置于離心管內(nèi)，加入磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入黃連、五味子提取液，分別在0、1、2、4、6、8、10h吸取懸浮液0.1mL，用三氯乙酸-硫酸亞鐵和鉬酸銨處理后，使用酶標(biāo)儀在630nm處測定處理液的OD值。同時(shí)做空白對(duì)照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥對(duì)潰瘍菌的抑制作用

11種中藥對(duì)潰瘍菌的抑制作用見圖1。

圖1 中藥對(duì)于潰瘍菌的抑制作用

由圖1可以看出，在體外抑菌試驗(yàn)中，除沉香、益智、高良姜對(duì)潰瘍菌沒有抑制作用外，其余的中藥都有抑制作用，中藥的對(duì)潰瘍菌抑制作用大小是黃連＞五味子＞丁香＞艾葉＞花椒＞虎杖＞蒼術(shù)＞牡丹皮，其中以黃連效果最好，五味子次之。

2.2 最低抑菌濃度（MIC/MBC）

選擇對(duì)潰瘍菌抑菌效果較好黃連和五味子進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 MIC/MBC

由表1可以看出，黃連、五味子的MIC和MBC結(jié)果相同，與上個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示顯示的黃連抑菌環(huán)直徑大于五味子的抑菌環(huán)直徑有差異，這種差異可能是由實(shí)驗(yàn)方法的不同所引起，但兩種方法所顯示黃連、五味子對(duì)于潰瘍菌抑制作用相近。

2.3 潰瘍菌的生長抑制曲線

黃連、五味子提取物對(duì)潰瘍菌的生長抑制作用見圖2。

圖2 生長抑制曲線

從圖2可以看出，黃連、五味子提取物對(duì)潰瘍菌的抑制、殺死作用與其濃度有關(guān)。當(dāng)黃連、五味子提取物濃度為64μg/mL時(shí)，在2h內(nèi)能夠殺死潰瘍菌；當(dāng)加入的濃度為8μg/mL，在一定時(shí)間內(nèi)（4h）抑制潰瘍菌的生長，但不能滅菌，隨著時(shí)間的延長，細(xì)菌開始迅速的生長繁殖。24h后（圖上未顯示），對(duì)照組的cfu達(dá)到5.67×108；加入8μg/mL黃連的cfu達(dá)到3.67×107，加入8μg/mL五味子的cfu達(dá)到2.9×107。結(jié)果顯示，加入黃連、五味子提取物濃度低于最低抑菌濃度時(shí)，雖然不能殺死潰瘍菌，但是能夠抑制潰瘍菌的生長，延緩其細(xì)菌數(shù)目的增加。

2.4 菌液中的可溶性總糖

糖類是細(xì)菌重要的碳源及能源儲(chǔ)備物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌生理狀態(tài)正常時(shí)，能夠吸收利用外源的糖類。細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，正常狀態(tài)下具有流動(dòng)性和半透性等功能，當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞后，其固有的功能將會(huì)喪失，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低和通透性增大，從而喪失對(duì)細(xì)菌菌體的保護(hù)作用，菌體內(nèi)容物（包括糖類）發(fā)生外泄。因此，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化可由菌液中糖含量的變化情況來反映[14-16]。時(shí)間的延長逐漸上升，然而，對(duì)照組均顯示了培養(yǎng)液中可溶性糖濃度沒有太多變化。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃連、五味子提取物能改變潰瘍菌細(xì)胞膜的通透性，使的菌體內(nèi)的糖類物質(zhì)逐漸滲漏到菌體外，造成了菌液中糖濃度的升高。

2.5 提取物對(duì)菌體磷代謝的影響

磷是細(xì)菌需要的微量元素，是核酸、磷脂及糖代謝的中間產(chǎn)物的重要組成成分，且在細(xì)胞能量代謝中起重要的作用[16]。細(xì)菌利用葡萄糖經(jīng)過一系列磷酸化反應(yīng),為生長繁殖提供所需能量，因此，通過檢測細(xì)菌代謝活動(dòng)中磷的消耗狀況可反映細(xì)菌菌體的整體代謝功能和生長狀態(tài)。從圖4可以看出，當(dāng)潰瘍菌與黃連、五味子作用后，與對(duì)照相比較, 磷消耗量均隨著作用時(shí)間的延長而逐漸降低，表明潰瘍菌的磷代謝受到影響，證明黃連、五味子不僅可以破壞細(xì)胞膜，還可以影響細(xì)胞中的磷代謝。

圖4 黃連、五味子處理后潰瘍菌的磷代謝變化

抗菌藥物對(duì)于細(xì)菌的抑制、殺死的主要靶標(biāo)有3個(gè)方面：一是對(duì)于細(xì)胞膜的破壞，干擾細(xì)胞膜的合成；二是對(duì)蛋白質(zhì)合成的干擾；三是對(duì)遺傳物質(zhì)的復(fù)制和修復(fù)的干擾破壞[18]。從本次實(shí)驗(yàn)研究表明，黃連、五味子提取物能夠抑制、殺死潰瘍菌，其抑菌、殺菌的效果與黃連、五味子提取物的劑量有直接的關(guān)系。

3 結(jié) 論

圖3 黃連、五味子提取物對(duì)菌液中糖含量的影響

如圖3所示，當(dāng)潰瘍菌與64μg/mL的黃連、五味子提取物作用后，菌液中可溶性糖的濃度隨著作用

研究結(jié)果表明，黃連、五味子提取物對(duì)潰瘍菌具有抑制、致死作用，且隨著濃度的增加，抑菌、殺菌效果也增加。這預(yù)示中藥乙醇提取物不僅在食品保藏方面有應(yīng)用價(jià)值，而且在獼猴桃潰瘍病的防治方面也具有開發(fā)利用價(jià)值。黃連、五味子提取物的抑菌、殺菌效果還與所用的劑量有關(guān)，其MIC為0.016mg/mL，MBC為0.064mg/mL。研究結(jié)果還表明，黃連、五味子提取物濃度高于0.064mg/mL，對(duì)潰瘍菌的細(xì)胞壁完整性造成破壞，引起潰瘍菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，造成內(nèi)部物質(zhì)如糖類等物質(zhì)外泄；還可以干擾潰瘍菌的磷代謝過程，造成細(xì)菌死亡，從而達(dá)到抑菌、殺菌目的。提取物的具體作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究和探討。

長期使用化學(xué)農(nóng)藥引起的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，使得尋找低毒、高效、低殘留、低污染的“綠色農(nóng)藥”成為了迫切的任務(wù)。植物源農(nóng)藥來源廣泛、具有低毒、低殘留、對(duì)非靶標(biāo)生物及環(huán)境的安全性，不易產(chǎn)生抗藥性，能夠降低或避免化學(xué)農(nóng)藥帶來的“農(nóng)藥公害”等優(yōu)點(diǎn)。植物源殺菌劑的研究正符合現(xiàn)代人們對(duì)農(nóng)藥的要求及其未來農(nóng)藥的發(fā)展方向，黃連、五味子為開發(fā)天然植物源殺菌劑增加了新的選擇。

[1]承河元，李瑤,萬嗣坤，等.安徽省獼猴桃潰瘍病病菌鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995,22(3):219-223.

[2]Nakajima Masami,Goto Masao,Akutsu Katsumi,et al.Nucleotide sequence and organization of copper resistance genes from Pseudomonas syringae pv.Actinidiae[J].European Journal of Plant Pathology,2004,110:223-226.

[3]王永剛，楊富民.植物源天然保鮮液對(duì)羊肉保鮮效果研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,43(5):150-154.

[4]吳小虎，艾啟俊，肖藝.天然中草藥果蔬防腐保鮮劑的研究與應(yīng)用[J].保鮮與加工，2006,6(2):4-6.

[5]張銳利，包東東，劉華英.不同提取方法對(duì)五味子提取物抑菌活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(24):13177-13179.

[6]鄒金美，陳蕓，陳秀橋，等.五味子提取物的抑菌活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,39(5):400-402.

[7]楊勇,葉小利，李學(xué)剛.4種黃連生物堿的抑菌作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007,18(12):3013-3014.

[8]王莘,蘇玉春,董浩,等.9種中藥提取物對(duì)乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用比較[J].中草藥,2004,35(3):309-310.

[9]A.Martins,A.Vasas,M.Viveiros,et al.ntibacterial properties of compounds isolated from Carpobrotus edulis[J].International Journal of Antimicrobial gents,2011,37:438-444.

[10]Gavin Rukholm,Clement Mugabe,Ali O.Azghani,et al.Antibacterial activity of liposomal gentamicin against Pseudomonas aeruginosa:a time-kill study[J].Journal of Antimicrobial Agents 2006,27:247-252.

[11]周莉君，宋良成，侯若，等.馬桑提取物的抑菌作用和抑菌機(jī)理的初步研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,43(5):1165-1169.

[12]錢麗紅，陶妍，謝晶.茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010,37(11):1628-1633.

[13]翟培，韓晉輝，侯麗霞，等.家蠅抗菌肽的抑菌動(dòng)力學(xué)研究及其機(jī)理初探[J].中國生物工程雜志，2006,26(11):33-39.

[14]謝晶，侯偉峰，湯毅，等.植酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)理[J].食品工業(yè)科技，2011,32(10):85-88.

[15]曾亮，黃建安，李赤翎，等.兒茶素的抑菌效果及機(jī)理研究[J].食品工業(yè)科技，2009,30(5):89-92.

[16]MT馬迪根，JM馬丁克，李明春，等.微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2009:95-113.

[17]劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2008:459-519.

[18]Christopher Walsh.Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance[J].Nature,2000,406(17):775-781.