中西藥聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制

段春蘭　張愛(ài)民　付桂珍

（1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3 烏蘭察布市化德縣醫(yī)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013350）

中西藥聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制

段春蘭1張愛(ài)民2付桂珍3

（1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3 烏蘭察布市化德縣醫(yī)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013350）

目的 探討氟尿嘧啶（5-FU）、斑貞1號(hào)和川芎嗪（TMP）聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞與乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）表達(dá)的相關(guān)性。方法 通過(guò)半定量RT-PCR比較人胃癌細(xì)胞在單純5-FU和5-FU聯(lián)合TMP和斑貞1號(hào)處理組BCRPmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 5-FU組與對(duì)照組相比，BCRP表達(dá)P＞0.05，無(wú)差異，而5-FU聯(lián)合TMP及斑貞1號(hào)處理組BCRP表達(dá)量明顯降低P＜0.05。結(jié)論 5-FU、斑貞1號(hào)和TMP聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR耐藥性可能與BCRP相關(guān)。

胃癌；多藥耐藥；斑貞1號(hào)；TMP；5-FU；BCRP

胃癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，胃癌的治療以手術(shù)和化療為主，由于目前沒(méi)有開(kāi)展胃癌篩查，患者確診時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，故化療顯得尤為重要，但目前化療結(jié)果差，造成這一結(jié)果主要原因是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）在胃癌多藥耐藥性方面起著重要作用，侯培珍等研究［1］已證實(shí)斑貞1號(hào)+TMP+5-FU對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用［1］。因此我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，旨在檢測(cè)不同藥物組BCRPmRNA的表達(dá)量，進(jìn)一步探討了中西藥對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑：斑貞1號(hào)按比例加斑蝥、女貞子、露蜂房、山茱萸共42.06 g，加入2000mL三蒸水，慢火加熱，至200mL時(shí)過(guò)濾，濃度為0.2103 g/mL的斑貞1號(hào)溶液。TMP、5-FU（南通精華制藥有限公司），新生小牛血清（賽默飛世爾生物化學(xué)制造）、二甲基亞砜（大連寶生物公司）、胰蛋白酶（北京經(jīng)科宏達(dá)公司），RT-PCR試劑盒及Trizol（TakaRa公司），RPMI1640（美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品），PCR引物序列（上海生工生物工程有限公司），細(xì)胞系：人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR細(xì)胞（西京醫(yī)院消化研究?jī)?nèi)科實(shí)驗(yàn)室所提供）。

1.2主要儀器和設(shè)備：電泳儀（DF-D，北京）、PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司）、紫外分光度計(jì)（SFZ0806011349，上海）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞處理：常規(guī)方法培養(yǎng)人為胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板上，每孔2mL，然后培養(yǎng)24 h，每孔分別加入新的培養(yǎng)液；5-FU稀釋液；斑貞1號(hào)稀釋液；5-FU+斑貞1號(hào)；5-FU+TMP+斑貞1號(hào)（根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果選藥物濃度，選IC50值）。然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS緩沖液沖洗1次，提取總mRNA。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)：采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，。

PCR每個(gè)樣品反應(yīng)體系25μL，即10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5μL，Takara Taq 1μL，dNTP Mixture 2μL，ddH2O 13.5μL，目的基因上、下游引物各0.5μL，（引物序列見(jiàn)表1）滅菌蒸餾水13.5μL，各樣品cDNA5μL。

BCRP擴(kuò)增條件：預(yù)變性、變性、退火、分別是93 ℃ 3min→93 ℃30s→54 ℃ 30s→72 ℃30s g共40個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10min；擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取10μL，100V條件下在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳60min。將電泳凝膠于紫外線下觀察并用凝膠成象系統(tǒng)照相分析，得到各電泳帶平均吸光度值。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件作處理，采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié) 果

2.1SGC7901/ADR細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后BCRP mRNA的表達(dá)：5-FU組BCRP mRNA表達(dá)量為（2.11±0.24），對(duì)照組為（2.20±0.26），二者比較P=0.23，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他藥物組與對(duì)照組及組間比較P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義斑貞1號(hào)+TMP+FU組表達(dá)量最少。

2.2所有RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均產(chǎn)生基因擴(kuò)增帶，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄完整性和PCR反應(yīng)是成功的。BCRP和-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于346 bp和528 bp，和預(yù)期長(zhǎng)度吻合，說(shuō)明均為特異性擴(kuò)增片段（圖1）。

圖1　細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后BCRP表達(dá)的凝膠圖像

表1　BCRP、-action基因上、下游引物。

3　討 論

在胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率及病死率居惡性腫瘤第二位［2］，化療是綜合治療胃癌的重要方法之一，目前大多數(shù)研究認(rèn)為胃癌的MDR是化療緩解率低的主要原因［3-4］，目前認(rèn)為多種因素參與腫瘤的多藥耐藥，Ningetal在研究胃癌干細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，BCRP在胃癌MDR中起重要作用［5］，BCRP是Doyle［6］首先發(fā)現(xiàn)于乳腺細(xì)胞中，故被稱為乳腺癌耐藥蛋白，它是第一個(gè)位于細(xì)胞膜上的新ABC半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量大小為2.4kb，基因定位于4q22.23，通過(guò)藥物溢出泵的機(jī)制導(dǎo)致耐藥，與多種瘤細(xì)胞泵的MRD相關(guān)。它與p-gp、MRP一樣，具有把化療藥物米托蒽醌、阿霉素等從腫瘤細(xì)胞里“泵出”的作用［7］。

中藥及其復(fù)方制劑由于多種活性成分并存，能通過(guò)多種途徑、多個(gè)靶點(diǎn)在腫瘤的治療中發(fā)揮作用［8］。本課題斑貞1號(hào)合劑主要有（露蜂房、山茱萸、女貞子、斑蝥素），主藥為斑蝥素和露蜂房，輔佐藥為山茱萸和女貞子，斑蝥素的抗腫瘤機(jī)制主要是抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成，降低癌毒激素水平及影響癌細(xì)胞的核酸代謝，女貞子具有扶正祛邪，抑制幽門(mén)螺桿菌的作用及抑制嘌呤異常代謝并對(duì)染色體損傷和突變具保護(hù)作用，TMP是一種鈣離子通道阻滯劑，通過(guò)多種途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。楊葉，侯培珍等［9］已證實(shí)川芎嗪能顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性；本文顯示，斑貞1號(hào)+TMP+5-FU對(duì)人胃癌SGC-7901/ ADR細(xì)胞有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用，本研究表明斑貞1號(hào)+5-FU+TMP組BCRP mRNA表達(dá)量低于其他用藥組，組間比P＜0.05，有顯著性差異，證明三種藥物聯(lián)合可抑制耐藥細(xì)胞BCRP mRNA的高表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了BCRP基因介導(dǎo)的多藥耐藥性，增強(qiáng)了治療效果。

［1］ 侯培珍，張娟，趙永峰.中西藥結(jié)合對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)和誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（13）：1181-1183.

［2］ 韓全利，張龍方，李靜，等.Ro60在耐藥胃癌細(xì)胞系SGC7901/ADR中的克隆及表達(dá)［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（12）：41-42.

［3］ Hao SL，Liu LK，Li YF.Miultidrug resistance mechanisms and reversal agents in gastric carcinoma cells ［J］.Cancer Res Clin，2007，19（1）：68-72.

［4］ 檀碧波.胃癌多藥耐藥異質(zhì)性的臨床與基礎(chǔ)研究［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2010.

［5］ 王新；胃癌SGC7901細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)新蛋白和基因的篩選及鑒定［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)；2001.

［6］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance tansproter from human MCF-7 breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15665-15670.

［7］ 張燕，金先慶，趙珍珍，等.5種耐藥基因在成人常見(jiàn)惡性腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32（10）：1023.

［8］ 盛桂琴.中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（5）：776-779.

［9］ 楊葉，侯培珍，張娟.川芎嗪聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901/ ADR的殺傷作用［J］.腫瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.

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1671-8194（2015）10-0074-02