一種大鼠心肌缺血模型的制作方法

呂沛然等

【摘要】目的：建立一種大鼠心肌缺血模型制作方法，保證模型制作的準確程度與術后大鼠存活率。方法：大鼠麻醉后，先行明視經(jīng)口氣管插管，呼吸機供給氧氣；次行開胸結扎冠狀動脈左前降支術；再行肺復張術；另術前及術后三天予以抗生素注射與體溫支持等措施。結果：經(jīng)過改進，造模準確率達到100%，術后四周存活率達到 80%。結論：控制結扎位置可提高模型準確率，術中供給氧氣可提高大鼠存活率。

【關鍵詞】心肌缺血；動物模型；大鼠；氧氣；冠狀動脈左前降支

【中圖分類號】R-332；R542.22 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0693-02

基金項目：國家自然科學基金（項目批準號：81373561）

在心肌缺血（MI）動物模型制作中，SD大鼠是常用動物[1]，行結扎冠狀動脈左前降支（LAD）手術是傳統(tǒng)造模方法。如何準確客觀模擬心肌缺血的病理改變且提高大鼠術后存活率是模型制作的關鍵。本研究課題組立足于本實驗室實際并參考眾多研究者經(jīng)驗[2、3]，建立了一種大鼠心肌缺血模型的制作方法，以期達到保證模型成功率與大鼠術后存活率的目的。

1實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

SD大鼠，20只，雌雄各半，2～4 月齡，體重250±30g，由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所中心提供（許可證號：SCXK（川）2013-15）。動物在手術操作前適應飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境為自然光暗周期，溫度23～26℃、相對濕度40%～70%，雌雄分開，5只/籠，自由飲水進食。

1.1.2手術器械及耗材

顯微持針鉗，開瞼器，7-0顯微帶線縫合針，4-0縫合線，○ 1/2 4×12醫(yī)用逢合針，24G靜脈留置針，鐵絲，常規(guī)手術器械與耗材。

1.1.3藥物

水合氯醛、0.9%氯化鈉注射液，注射用青霉素鈉，碘伏、75%乙醇，PBS磷酸鹽緩沖液、TTC染色液。

1.1.4儀器設備

肯特Kent PhysioSuite （Monitor for Mice and Rats） ，氧氣袋，CMA/450動物恒溫控制器，BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)，自制鼠臺，強光手電筒。

1.2實驗方法

1.2.1麻醉

7%水合氯醛氯化鈉溶液以280mg/kg（0.4ml/100g）比例對大鼠進行腹腔注射麻醉，再腹腔注射青霉素8萬U預防感染，然后將其仰臥位固定于鼠臺上，前胸部備皮，碘伏消毒。

1.2.2氣管插管及呼吸機設置

采用明視經(jīng)口氣管插管的方法，并通過呼吸機供給醫(yī)用氧氣。

氣管插管。將24G靜脈留置針剪去前端留約5 cm軟管，插入細鐵絲，醫(yī)用棉簽擦拭其口腔，術者一手向外上方提起大鼠舌頭，另一手持留置針，助手持手電筒照射其頸部，術者經(jīng)口腔觀察到大鼠的聲門襞隨著呼吸節(jié)律開合，將留置針抵在氣管口，當聲門襞打開時順勢將留置針推入氣管，手下有留置針向前推進時與環(huán)狀軟骨相碰撞的頓挫感，退出鐵絲，置一絲棉絮留置針口，若其隨呼吸被吹動可確定插管成功。

呼吸機設置。將留置針與肯特Kent PhysioSuite相連。其進氣口連接氧氣袋，供給氧氣。根據(jù)大鼠體重設置相關呼吸輔助參數(shù)，儀器自動設置呼吸頻率，范圍在65～81次/分，手動設置潮氣量，比例為1ml/100g體重，吸呼比1：1，嘆息通氣比為1：60。

1.2.3開胸手術及結扎

連接BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)，監(jiān)測并記錄手術過程中心電圖的變化。開胸手術：雌鼠于左側胸部第二與第三乳頭間中上三分之一處，垂直前正中線剪開皮膚2～2.5 cm（雄鼠剪開皮膚位置參考對比雌鼠），常規(guī)鈍性分離筋膜層與肌肉層，暴露肋層。于第三肋間靠近胸骨處，止血鉗迅速穿破肋間肌，沿肋間橫向分離肌肉約1～1.5 cm，放入開瞼器，撐開第四肋間，充分暴露視野。

結扎LAD。撕破心包膜，暴露左心耳與肺動脈圓錐，可察及暗紅色的為左冠狀靜脈主干，冠狀動脈左前降支（LAD）與之緊密伴行。以左心耳、肺動脈圓錐與左冠狀靜脈主干為標志，在其下緣連線下方約2 mm處確定冠狀動脈左前降支（LAD）位置，7-0顯微帶線縫合針垂直于左冠狀靜脈主干約2 mm進針，深度約1～1.5 mm，寬度約3～4 mm，于其冠狀靜脈主干另一側約2mm處出針，結扎冠狀動脈左前降支（LAD）。結扎后，肉眼可觀察到結扎位置及以下冠狀動脈左前降支供血區(qū)心肌變白，心電圖中ST段抬高。

1.2.4關胸

撤下開瞼器，縫合肋間。肋間縫合完畢后，術者在由兩側向中間擠壓大鼠胸腔的同時，助手堵住呼吸機的出氣口，約2～3 秒，助大鼠肺復張，刺激其自主呼吸，并恢復胸腔負壓。常規(guī)縫合肌肉層與皮膚，可重復擠壓胸腔的操作。

縫合完畢，觀察大鼠的呼吸情況，若其自主呼吸明顯，試停呼吸機，待到大鼠呼吸平穩(wěn)即可撤下呼吸機。

1.2.5 術后護理

將大鼠以右側臥位置于鋪好干凈墊料的鼠籠中，單籠飼養(yǎng)。

未蘇醒時，要對大鼠進行保暖以防其體溫過低死亡。術后約1.5～2h后，大鼠或有翻身掙扎，此時可用注射器向其口角滴飲用水，一般情況下大鼠就會主動飲水，既補充液體，又刺激其蘇醒。術后連續(xù)3天每天腹腔注射青霉素8萬U，每天更換墊料、供給飲用水與新鮮飼料。

2結果

2.1模型成功標準

造模成功與否可由結扎LAD后心電圖的變化與心肌顏色的變化進行判定，還可以有一些手術后大鼠行為學的改變作為參考，并做心臟切片TTC染色加以確認。

2.1.1術中心肌顏色與心電圖改變

結扎LAD后，可觀察到結扎位置及以下心肌變白，提示結扎到位。

正常心電圖、結扎后心電圖如圖1、圖2，結扎后可明顯觀察到S-T段的改變[4]，提示結扎到冠狀動脈左前降支，造模成功。

箭頭所示，結扎后S-T段抬高。

2.1.2大鼠行為學改變

術后飼養(yǎng)時可觀察到大鼠背毛乍起，常呈弓背體位[5]，且進水、飲食等活動減少。

2.1.3心肌TTC染色

術后第四周末，由股靜脈注射適量10% KCL處死大鼠，打開胸腔迅速取出心臟，剪去多余組織，4℃生理鹽水沖凈瘀血，-20℃冷凍2小時后，由心尖向結扎位置垂直心臟長軸做2～3 mm切片，置于適量0.1%TTC溶液中37℃溫育5min左右，結果如圖3，結扎位置以下缺血區(qū)心肌為白色。

箭頭所示，結扎位置及以下缺血區(qū)心肌染色結果為白色。

2.2 大鼠術后成活率

共計20只大鼠，4只術后撤下呼吸機后死亡，余16只成活至術后第四周末，成活率80%。

結論

一個穩(wěn)定且可復制的動物模型是實驗研究開展的基礎，在大鼠心肌缺血模型的制作中有很多細節(jié)需要把握，經(jīng)過反復的手術操作練習，才能保證模型的準確與穩(wěn)定。

參考文獻

[1]李峰杰，李貽奎.心肌梗死動物模型研究進展[J].中國藥理學通報，2013，29（1）：5-10.

[2]王燕，陳光輝，尹作民，劉為生.大鼠心肌梗死動物模型的制備[J].中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（6）：54-57，90.

[3]劉開宇，田海，孫露，李大為，賈智博，蔣樹林，李仁科.標準化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2007，41（6）：531-534.

[4]何濤.大鼠心肌梗死模型的病理與心電圖變化研究 [D]廣西醫(yī)科大學

[5]. Degabriele Naomi M， Griesenbach Uta， Sato Kaori， Post Mark J， Zhu Jie， Williams John， Jeffery Peter K ， Geddes Duncan M， Alton Eric W F W. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction [J] . Experimental physiology， 2004， 89 （4）：497-505.