農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花魔芋遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

陳 磊 郭政宏等

摘要

[目的] 探討魔芋愈傷組織培養(yǎng)基、不同轉(zhuǎn)化條件（菌液濃度、侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間）及轉(zhuǎn)化植株的篩選條件（抗生素濃度和乙酰丁香酮（AS）濃度）等因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。[方法]采用卡那霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花魔芋遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]在預(yù)培養(yǎng)2 d，用OD600為0.6的菌液侵染30 min、共培養(yǎng)3 d，卡那霉素100 mg/L，羧芐青霉素250 mg/L，AS濃度100 μmol/L的條件下能有效提高轉(zhuǎn)化效率。再生花魔芋植株經(jīng)GUS染色及PCR檢測(cè)，結(jié)果表明外源目的基因已經(jīng)整合到花魔芋基因組中。[結(jié)論] 為魔芋抗病品種的轉(zhuǎn)基因培育，豐富其種質(zhì)資源，尋找抗病新途徑提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 花魔芋；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）05-021-04

Optimized Genetic Transformation System of Amorphophallus konjac Mediated by Agrobacterium tumfaciens

CHEN Lei， GUO Zhenghong， CHENG Haili， YUE Chaoyin*

（Biotechnology Research Center， Three Gorges University， Yichang， Hubei 443002）

Abstract [Objective] Factors that influence Agrobacterium tumfaciensmediated transformation of Amorphophallus konjac， including culture medium， transformation conditions and selection reagents were investigated. [Method]An transformation system mediated by Agrobacterium tumfaciens has been optimized to obtain transgenic plants of Amorphophallus konjac by using kanamycin resistance gene as marker gene. [Result]The results showed that preculture for 2 days before infection by Agrobacterium （OD600= 0.6， 30 min） and then coculture for 3 days yielded the highest rate of antibiotic resistant callus formation with the addition of kanamycin （100 mg/L）， carbenicillin （250 mg/L） and acetosyringone（100 μmol/L）. The transgenic plants were screened and reclarified by GUS staining and PCR analysis that the exogenous gene was integrated into Amorphophallus konjac genome.[Conclusion] The study provided theoretical basis and experimental basis for cultivating genetically resistant varieties， riching germplasm resources and finding new ways for disease resistance.

Key words Amorphophallus konjac；Agrobacterium tumfaciens；Genetic transformation system

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30871579）。

作者簡介

陳磊（1990-），男，湖北孝感人，碩士研究生，研究方向：微生物與植物互作。*通訊作者，教授，博士，從事微生物與植物互作研究。

收稿日期 20141222

魔芋（Amorphophallus）屬天南星科（Areaceae）魔芋屬多年生草本植物，其變態(tài)莖宿存于地下，通常呈球形、扁球形或柱狀球形[1]，主要栽培種為花魔芋Amorphophallus konjac）和白魔芋（Amorphophallus albus）。魔芋塊莖內(nèi)富含葡甘聚糖（Konjac glucomannan）、各種人體必需氨基酸和微量元素[2]。葡甘聚糖可廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健、農(nóng)業(yè)、化工、紡織、石油鉆探等領(lǐng)域，具有極大的商業(yè)價(jià)值。

隨著魔芋種植面積的不斷擴(kuò)大，魔芋軟腐病的發(fā)生也逐年加劇，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失達(dá)30%～50%，嚴(yán)重的達(dá)80%以上，甚至絕收[3]，嚴(yán)重影響農(nóng)民種植魔芋積極性。魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐氏桿菌軟腐病亞種（Erwinia carotovora Var. cartovora）侵染所致[4]，該病有2個(gè)明顯的特征，即組織腐爛和有惡臭味，不僅在魔芋田間生長階段發(fā)病，造成葉片、葉柄及塊莖軟腐，還可在魔芋貯藏期間發(fā)病造成塊莖腐爛。

自1983年人類首次獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展十分迅速，該項(xiàng)技術(shù)目前已成為植物性狀遺傳改良的重要手段。2000年新加坡國立大學(xué)Dong等[5]從芽胞桿菌Bacillus 240B1中克隆到抗軟腐病aiiA基因，將該基因轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯后，獲得的轉(zhuǎn)基因植株具有較好的軟腐病抗性。但魔芋的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，到目前為止，國外未發(fā)現(xiàn)這方面的報(bào)道，國內(nèi)僅有幾例抗軟腐病遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)報(bào)道。張興國等[6]采用RT-PCR方法從白魔芋組培苗的幼嫩球莖組織中克隆到ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因。周盈等[7]初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)花魔芋遺傳轉(zhuǎn)化體系，但并未進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化及后續(xù)感病試驗(yàn)來驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因魔芋的抗軟腐病能力。