水曲柳CBF1基因的克隆及表達(dá)分析

何之龍 詹亞光

摘要 [目的]探討水曲柳CBF基因的表達(dá)及與生物鐘調(diào)控的關(guān)系。[方法] 利用cDNA 末端快速克?。≧ACE）技術(shù)克隆水曲柳CBF1基因的全長序列，并對(duì)三年生水曲柳幼苗葉片中FmCBF1基因的時(shí)間表達(dá)特征進(jìn)行初步研究。[結(jié)果]利用RNA末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法從水曲柳中克隆得到1個(gè)CBF基因家族成員FmCBF1 （GenBank： KJ541508.1），該基因ORF 669bp，推測(cè)編碼蛋白質(zhì)含有222個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量24.5 kD，理論等電點(diǎn)為5.11，在DNA序列內(nèi)不含內(nèi)含子。氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，水曲柳FmCBF1基因與白樺BpCBF1同源性最高，相似性達(dá)79.4%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中處于同一分支上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)特性分析顯示， FmCBF1基因的表達(dá)具有一個(gè)大約以24 h為周期的節(jié)律性，最大值約出現(xiàn)在9：00，而夜間卻處于較低的表達(dá)水平。在4 ℃低溫處理1、3、6、12、24、72和120 h后FmCBF1的qRTPCR分析表明，該基因受到低溫誘導(dǎo)，并在4 ℃條件下隨低溫時(shí)間的延長，該基因的誘導(dǎo)表達(dá)特性呈先升后降的趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在12h時(shí)，達(dá)對(duì)照的25.5倍。[結(jié)論]為進(jìn)一步研究水曲柳抗旱耐寒性及分子育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水曲柳 ；基因克??；CBF；晝夜節(jié)律

中圖分類號(hào) S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）05-015-06

Cloning and Expression Analysis of FmCBF1 Genes from Fraxinus mandschurica

HE Zhilong1， ZHAN Yaguang1，2*， ZENG Fansuo1，2

（1. Life Science College， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040；2. National Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to investigate the relationship between expression of FmCBF1 Genes from Fraxinus mandschurica

and clock control.[Method] FmCBF1 was cloned from Fraxinus mandschurica seedlings by rapid amplification of cDNA ends （RACE）. [Result] FmCBF1 contained a 669 bp complete open reading frame （ORF） which encoded a peptide of 222 amino acids. The predicted molecular weight and isoelctric point of FmCBF1 were 25.5 kD and 5.11， respectively. There was no intron in the DNA sequence of FmCBF1. The results of homology comparison showed that FmCBF1 protein shared 79.4% homology with Betula platyphylla BpCBF1， they were in the same branch in the phylogenetic tree. Expression analysis showed that the transcript level of CBF1 oscillated with a peak occurring at about 9 oclock in the morning followed by a second peak about 24 h later. Time course of the genes expressions at 4 ℃ for 1， 3， 6 12， 24， 72 and 120 h showed that its expression increased at the first and then decreased， and its peak occurring at 12 h after the callus was moved to 4℃ stress， and its expression was 25.5 times higher than CK.[Conclusion] The study laid foundation for study on drought cold and molecular breeding of Fraxinus mandschurica.

Key words Fraxinus mandschurica； Cloning； CBF； Circadian

基金項(xiàng)目 國家林業(yè)科技支撐項(xiàng)目（2011BAD0213）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270697）。

作者簡(jiǎn)介 何之龍（1988- ），男，湖南株洲人，博士研究生，研究方向：植物基因工程。

*通訊作者。

收稿日期 20141222

干旱響應(yīng)元件（Crepeat/dehydration responsive element，CRT/DRE）是一種植物中DNA調(diào)控的順式作用元件，它位于COR（coldregulated）以及其他一些受低溫誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子上，能刺激低溫和水分缺失下的轉(zhuǎn)錄起始[1]。CBF/DREB1蛋白是DNA結(jié)合蛋白AP/EREBP家族中的一種轉(zhuǎn)錄激活因子，研究發(fā)現(xiàn)，在逆境條件下CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子能有效地與CRT/DRE結(jié)合，并激活其下游COR基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高植物抵抗低溫、干旱以及高鹽等非生物脅迫的能力[2]。CBF1、CBF2和CBF3基因也稱為干旱響應(yīng)元件結(jié)合因子1B（DREB1B），DREB1C和DREB1A是CBF/DREB1基因家族中被研究較多的成員，研究表明CBF1、CBF2和CBF3基因受生物鐘調(diào)控，且它們受低溫的誘導(dǎo)作用也受生物鐘的限制[3]。為探討水曲柳CBF基因的表達(dá)及與生物鐘調(diào)控的關(guān)系，筆者利用cDNA 末端快速克?。≧ACE）技術(shù)克隆水曲柳CBF1基因的全長序列，并對(duì)三年生水曲柳幼苗葉片中FmCBF1基因的時(shí)間表達(dá)特征進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究水曲柳抗旱耐寒性及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料。

供試材料為三年生水曲柳幼苗，取自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒。

所用大腸桿菌菌株為E.Coli JM109，克隆載體為pMD18T vector（購自大連寶生物工程公司）。

1.1.3 酶和生化試劑。

DNase I、DNA Marker DL2000、DNA連接試劑盒、IPTG、XGal以及rTaq聚合酶等購自大連寶生物工程公司，CTAB、DEPC、TrisBase、氯仿以及無水乙醇等購自哈爾濱伊事達(dá)生物工程公司，cDNA 末端快速克?。≧ACE）試劑盒為Clontech 產(chǎn)品。

1.1.4 PCR引物。

以水曲柳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中獲得的CBF1基因cDNA的部分片段，設(shè)計(jì)PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列：

水曲柳FmCBF1 5′RACE：CBF15r1：CATCAACCCTTCAGCCATATCG；

及巢式PCR引物：CBF15r2：AAATCTGGTAAGTGGGTGTGTG；

水曲柳FmCBF1 3′RACE：CBF13f1：GGCATTAGCAGAGCCAATTTTT；

及巢式PCR引物：CBF13f2：TGAATGTCCTTAGCATCAGTGG；

水曲柳FmCBF1基因全長引物：FmCBF1F：GATTAATGGATATTTTAACAAATC，

FmCBF1R：ATGGCTAAGAAGAACCCTAA；

水曲柳FmCBF1熒光定量PCR引物：

qCBF1F：AAATCTGGTAAGTGGGTGTGTG，

qCBF1R：TGAATGTCCTTAGCATCAGTGG；

水曲柳Tubulin（Tu）內(nèi)參引物：FmTuF：AGGACGCTGCCAACAACTTT，

FmTuR：TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水曲柳FmCBF1基因的克隆、連接轉(zhuǎn)化及測(cè)序。

1.2.1.1 植物基因組DNA和總RNA的提取。

用CTAB法[4]提取水曲柳基因組DNA和總RNA，水曲柳總RNA經(jīng)過DNase I 消化DNA后測(cè)定RNA濃度，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 水曲柳FmCBF1基因5′RACE和3′RACE的克隆。

使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒合成5′RACEReady cDNA和3′ RACEReady cDNA，操作參照說明書。PCR反應(yīng)體系見表1。

注：PCR反應(yīng)液包含10×PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2+ Plus）2 ul，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 ul，Taq酶 0.2 ul，ddH2O 11.8 ul。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，然后以94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物稀釋100倍進(jìn)行巢式PCR，PCR反應(yīng)體系見表2。

注：巢式PCR反應(yīng)液包含10×PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2+ Plus）2 ul，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 ul，Taq酶 0.2 ul，ddH2O 13.4 ul。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，然后以94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并取4 ul膠回收產(chǎn)物與pMD18T vector進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，操作參照說明書。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，涂布在含有Amp、IPTG和XGal的LB培養(yǎng)基上，倒置37 ℃暗培養(yǎng)過夜，藍(lán)白斑篩選重組子。用M1347/RVM通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，最后將陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得的5′RACE和3′RACE進(jìn)行拼接，獲得水曲柳CBF1基因的全長。

1.2.1.3 水曲柳CBF1基因cDNA全長的克隆。

根據(jù)拼接所得的水曲柳CBF1基因序列設(shè)計(jì)全長引物FmCBF1F：5′ GATTAATGGATATTTTAACAAATC3′；FmCBF1R：5′ ATGGCTAAGAAGAACCCTAA3′。用水曲柳基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系：10× PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2+ Plus）2 ul，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 ul，上下游引物各 1 ul，模板 2 ul，Taq酶 0.2 ul，ddH2O 12.2 ul。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，然后以94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。回收PCR產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，藍(lán)白斑篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 水曲柳FmCBF1基因cDNA的序列分析。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行比對(duì)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），找出與該基因同源性較高的其他物種的氨基酸序列，然后用MEGA5軟件進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中的ORFfinder軟件找出水曲柳FmCBF1基因的開放讀碼框，然后利用Expasy工具（http：//au.expasy.org/tools/）中提供的ProtParam軟件和ProtScale軟件分別進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和親/疏水性的預(yù)測(cè)分析[5]；利用Expasy工具中的SOPMA 軟件在線預(yù)測(cè)分析α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等，然后利用網(wǎng)站Expasy工具中的PSORT 軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用CBS TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)跨膜域；并利用SWISSMODEL同源建模服務(wù)器（http：//swissmodel.expasy.org）在線預(yù)測(cè)分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[6-9]。

1.2.3 水曲柳FmCBF1基因的晝夜表達(dá)特征。

對(duì)三年生水曲柳幼苗葉片中FmCBF1基因的時(shí)間表達(dá)特征進(jìn)行初步研究，從3：00開始對(duì)三年生水曲柳幼苗的葉片進(jìn)行取樣，并用液氮速凍保存，每隔3 h重復(fù)取樣，持續(xù)48 h。將所取植物樣品的cDNA作為模板，以Tubulin作為內(nèi)參基因，用FmCBF1熒光定量引物qCBF1F/R進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，產(chǎn)物大小203 bp。參照TAKARA公司SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）說明書建立20 ul反應(yīng)體系，在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行操作。用2-ΔΔCT法[10]分析水曲柳FmCBF1基因的表達(dá)情況。

1.2.4 低溫脅迫對(duì)水曲柳FmCBF1基因表達(dá)的影響。

將一組長勢(shì)相同的水曲柳無性系愈傷組織放于4 ℃黑暗條件下（控溫冰箱）分別處理1、3、6、12、24、72和120 h。處理后將愈傷組織用液氮速凍，提取總RNA，消化，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、待用。每一處理均重復(fù)3 次。按“1.2.3”方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，分析低溫脅迫下FmCBF1基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 水曲柳CBF1基因的克隆

進(jìn)行5′RACE和3′RACE的克隆后分別獲得648 bp和664 bp的兩段序列（圖1）。將5′RACE和3′RACE測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后獲得的水曲柳CBF1基因片段大小為898 bp，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)全長引物FmCBF1F/R（表1）進(jìn)行DNA水平水曲柳FmCBF1基因的全長序列克隆，結(jié)果獲得長度為717 bp的核酸序列，與5′RACE和3′RACE測(cè)序后拼接成的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該基因編碼區(qū)不含有內(nèi)含子，用ORF Finder預(yù)測(cè)編碼區(qū)為669 bp，編碼222個(gè)氨基酸（圖2）。經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果表明，該基因與毛果楊CBF1基因同源性為79%，證明該基因?qū)儆贑BF家族，將其命名為FmCBF1。

注：A.5′RACE產(chǎn)物；B.3′RACE產(chǎn)物；C.FmCBF1全長擴(kuò)增產(chǎn)物；D.FmCBF1定量PCR產(chǎn)物。

2.2 水曲柳FmCBF1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 水曲柳FmCBF1基因的氨基酸序列比對(duì)以及進(jìn)化樹分析。

將FmCBF1基因的核酸序列提交NCBI進(jìn)行在線比對(duì)，選擇與其同源性較高的9個(gè)物種的CBF1/DREB1B氨基酸序列，大豆（gi|169668007|gb|ACA64423.1| CRT binding factor 1 Glycine max）、毛果楊（gi|134038590|gb|ABO48363.1| Crepeat binding facor 1 Populus trichocarpa）、巨桉（gi|376372833|gb|AFB35599.1| trancription factor CBF1 Eucalyptus grandis）、白樺（gi|325512537|gb|ADZ23479.1| CBF transcription factor 1 Betula platyphylla）、擬南芥（gi|2980801|emb|CAA18177.1| transcriptional activator CBF1/ CRT/CRE binding factor 1 Arabidopsis thaliana）、葡萄（gi|674267993|gb|AIL00520.1| Crepeat binding factor 1 Vitis vinifera）、馬鈴薯（gi|114432126|gb|ABI74671.1| Crepeat binding factor 1 Solanum tuberosum）、大麥（gi|347949839|gb|AEP32124.1| CBF protein 1 Hordeum vulgare）和水稻（gi|32966057|gb|AAP92125.1| transcription factor CBF1 Oryza sativa）進(jìn)行同源比對(duì)（圖3）。結(jié)果顯示，F(xiàn)mCBF1基因編碼的氨基酸序列與這些物種相似序列的同源性在71.8%～78.9%，其與白樺同源性最高，達(dá)78.9%；其與水稻同源性最低，為71.8%。蛋白分析結(jié)果表明，該蛋白與其他植物的CBF蛋白一樣也具有AP結(jié)構(gòu)域，并含有2個(gè)被稱為PKKPAGRKKFRETRHP和FADSAWR的蛋白簽名序列（Signature Sequences），它們分別位于AP結(jié)構(gòu)域的上游和下游。將上述9個(gè)氨基酸與水曲柳FmCBF1氨基酸序列用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖4可以看出，水曲柳FmCBF1與白樺CBF1處于同一分支上，具有較高的同源性。

2.2.2 水曲柳FmCBF1基因的氨基酸組成、理化性質(zhì)以及親/疏水性分析。

用ExPaSy Protparam對(duì)FmCBF1基因所編碼的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因預(yù)測(cè)編碼222個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為24 572.3，分子式為C1076H1671N299O345S8，等電點(diǎn)為5.11；其中帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp + Glu）、帶正電荷的氨基酸（Arg + Lys）比例分別為14.4%和11.7%；不穩(wěn)定指數(shù)（II）為55.14，分類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

用ExPaSy ProtScale對(duì)FmCBF1基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果（圖5A）顯示，疏水性最高的位于185位的甲硫氨酸（M），親水性最高的位于56位的丙氨酸（A），水曲柳FmCBF1基因?qū)儆谟H水性蛋白。

2.2.3 水曲柳FmCBF1基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析。

利用CBS TMHMM2.0預(yù)測(cè)FmCBF1基因編碼的蛋白質(zhì)跨膜域，結(jié)果顯示，不存在跨膜螺旋，且無信號(hào)肽，由此可以推測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)為膜內(nèi)蛋白。FmCBF1基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該基因可能定位于細(xì)胞核內(nèi)。FmCBF1基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，該蛋白結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)占36.49%，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占4.05%，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占48.65%，延伸鏈占10.81%。

利用SWISSMODEL同源建模服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維建模，預(yù)測(cè)水曲柳FmCBF1基因所編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)

注：A.水曲柳FmCBF1蛋白質(zhì)的親/疏水性分析；B.FmCBF1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C.FmCBF1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D.FmCBF1蛋白跨膜域分析。

圖5 水曲柳FmCBF1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用ExPaSy PSORT軟件對(duì)FmCBF1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核、葉綠體基質(zhì)、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體空間中的幾率不同（細(xì)胞核98.0%，葉綠體基質(zhì)55.4%，葉綠體類囊體膜25.7%，葉綠體類囊體空間25.7%。），其中以定位于細(xì)胞核中的可能性最大。將白樺、毛果楊及毛白楊的CBF1蛋白序列按相同的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果均與水曲柳FmCBF1蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果相似，說明CBF1蛋白在高等木本植物中的亞細(xì)胞定位可能較為一致。

2.3 水曲柳FmCBF1基因的表達(dá)分析

2.3.1 水曲柳FmCBF1基因的晝夜表達(dá)特征。

將第1天3：00的FmCBF1基因表達(dá)量作為對(duì)照（即相對(duì)表達(dá)量為1）。晝夜表達(dá)結(jié)果顯示（圖6A），F(xiàn)mCBF1基因的表達(dá)具有一定的周期性，且周期約為24 h。FmCBF1基因周期性表達(dá)的最大值約出現(xiàn)在9：00，第1天及第2天9：00的FmCBF1表達(dá)量分別為對(duì)照的12.5倍和8.0倍，均為當(dāng)天的最大值；而夜間卻處于較低的表達(dá)水平。

2.3.2 低溫脅迫對(duì)水曲柳FmCBF1基因表達(dá)的影響。

在低溫脅迫下，CBF基因都具有瞬時(shí)表達(dá)特性。受低溫脅迫誘導(dǎo)后，短時(shí)間內(nèi)即被強(qiáng)烈誘導(dǎo)并表達(dá)，但隨著時(shí)間推移，誘導(dǎo)作用逐漸減弱。FmCBF1基因也具有這種特性（圖6B），F(xiàn)mCBF1基因在4 ℃下短時(shí)間內(nèi)即被誘導(dǎo)，直到12 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，為CK的25.5倍；而后FmCBF1基因的表達(dá)開始下降，直到4 ℃下第3天和第5天，相對(duì)表達(dá)量分別為CK的0.09倍和0.14倍。這可能與長時(shí)間的4 ℃暗培養(yǎng)條件下對(duì)植物的生理活動(dòng)產(chǎn)生了抑制作用有關(guān)。

注：A.FmCBF1基因的晝夜表達(dá)特征；B.4 ℃不同時(shí)間下FmCBF1基因相對(duì)表達(dá)差異。

圖6 水曲柳FmCBF1基因的表達(dá)特征

3 討論

植物中CBF基因家族參與眾多的非生物脅迫的響應(yīng)，如低溫、干旱和鹽堿等，尤其在低溫脅迫響應(yīng)中是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子[11]。自1997年，Stockinger等[12]首次從擬南芥中克隆到CBF1轉(zhuǎn)錄因子依賴，大量研究中，許多其他物種CBF基因家族成員陸續(xù)被鑒定出來，并分析了其表達(dá)特征。該試驗(yàn)通過RACE技術(shù)首次從水曲柳中克隆得到CBF基因家族的成員FmCBF1基因的全長序列，該基因與其他木本植物中已知的CBF1基因所編碼的蛋白質(zhì)比對(duì)，具有較高的同源性，而且該蛋白具有明確的CBF蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征，蛋白序列上含有與低溫誘導(dǎo)的下游基因COR等啟動(dòng)子上CRT/DRE元件結(jié)合的AP結(jié)構(gòu)域，表明該基因?qū)儆贑BF家族。

2011年，Malia等[3]提出在擬南芥中，CBF1、CBF2和CBF3可能直接受到植物生物鐘元件CCA1/LHY基因的調(diào)控，且其轉(zhuǎn)錄水平以一個(gè)峰值出現(xiàn)在ZT8（Zeitgeber Time，晝夜時(shí)點(diǎn)），而下一個(gè)峰值出現(xiàn)在約24 h后的周期發(fā)生振蕩。該試驗(yàn)對(duì)該基因晝夜表達(dá)特征進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，F(xiàn)mCBF1基因的表達(dá)具有一個(gè)約以24 h為周期的節(jié)律性，最大值約出現(xiàn)在9：00，而夜間卻處于較低的表達(dá)水平。

在4 ℃低溫不同時(shí)間的處理下，F(xiàn)mCBF1基因表現(xiàn)出隨著處理時(shí)間的延長，表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)升高，12 h達(dá)到最大值，然后呈降低趨勢(shì)。此種受到低溫誘導(dǎo)后，隨時(shí)間的延長誘導(dǎo)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，與大部分植物中CBF基因的表達(dá)模式相符，擬南芥中除AtCBF4外，AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3都有此種現(xiàn)象[13-15]。

該研究結(jié)果表明FmCBF1基因是水曲柳CBF低溫響應(yīng)通路中的重要成員，具有傳遞低溫脅迫信號(hào)到下游基因的重要作用，對(duì)其進(jìn)行研究為培育抗逆性強(qiáng)的水曲柳新品種奠定了基礎(chǔ)。然而為了培育新品種，F(xiàn)mCBF1基因啟動(dòng)子的克隆，以及FmCBF1植物表達(dá)載體構(gòu)建將是下一步研究的方向。

利用植物基因工程是增強(qiáng)植物抗逆性的一種重要方式，然而由于植物的抗逆性是受眾多基因調(diào)控的，單基因的引入只能增強(qiáng)植物部分抗逆性，所以近年來，逆境響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的克隆和鑒定成為研究熱點(diǎn)。由于CBF基因家族在植物抗逆性中的重要作用，成功克隆得到水曲柳CBF基因家族的成員FmCBF1基因的全長序列，對(duì)于培育抗逆性強(qiáng)的水曲柳新品種奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] SARAH J G，SARAH G F，MICHAEL F T.Arabidopsis transcriptional activators CBF1，CBF2，and CBF3 have matching functional activities[J].Plant Molecular Biology，2004，54：767-781.

[2] MICHAEL F T.Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance[J].Plant Physiology，1998，118：5.

[3] MALIA A D，EVA M F，MICHAEL F T.CIRCADIAN CLOCKASSOCIATED 1 and LATE ELONGATED HYPOCOTYL regulate expression of the CREPEAT BINDING FACTOR（CBF）pathway in Arabidopsis[J].PNAS，2011，108（17）：7241-7246.

[4] 曾凡鎖，南楠，詹亞光.富含多糖和次生代謝產(chǎn)物的白樺成熟葉中總RNA的提取[J].植物生理學(xué)通訊，2007，43（5）：913-916.

[5] 范阿棋，毛娟，劉思妍，等.馬鈴薯StSnRK2.2基因克隆與生物信息學(xué)分析[J].植物研究，2013，33（3）：294-301.

[6] BENKERT P，BIASINI M，SCHWEDE T.Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J].Bioinformatics，2011，27（3）：343-350.

[7] ARNOLD K，BORDOLI L，KOPP J，et al.The SWISSMODEL Workspace：A webbased environment for protein structure homology modeling[J].Bioinformatics，2006，22：195-201.

[8] SCHWEDE T，KOPP J，GUEX N，et al.SWISSMODEL：an automated protein homologymodeling server[J].Nucleic Acids Research，2003 31：3381-3385.

[9] GUEX N，PEITSCH M C.SWISSMODEL and the SwissPdbViewer：An environment for comparative protein modeling[J].Electrophoresis，1997，18：2714-2723.

[10] KENNETH J L，THOMAS D S.Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[11] 王京京，童再康，黃程前，等.巨桉EgrCBF1和EgrCBF2基因的克隆和脅迫響應(yīng)表達(dá)分析[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（10）：41-48.

[12] STOCKINGER E J，GILMOUR S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domaincontaining transcriptional activator that binds to the Crepeat/DRE，a cisacting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：1035-1040.

[13] GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in coldinduced COR gene expression[J].Plant J，1998，16（4）：433-442.

[14] MEDINA J，BARGUES M，TEROL J，et al.The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domaincontaining proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration[J].Plant Physiol，1999，119（2）：463-470.

[15] HAAKE V，COOK D，RIECHMANN J L，et al.Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis[J].Plant Physio，2002，130（2）：639-648.

責(zé)任編輯 李占東 責(zé)任校對(duì) 李巖