溶瘤病毒誘導(dǎo)腫瘤凋亡及激活抗腫瘤免疫機(jī)制的研究進(jìn)展

金升燁 綜述 龐達(dá) 審校

惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的第二大疾病，每年患病人數(shù)以及死亡人數(shù)均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[1]。目前為止，對(duì)于惡性腫瘤的治療，臨床中以外科手術(shù)切除、化療藥物治療以及放射治療為主，部分早期患者可以在治療中獲得較大的收益。但由于惡性腫瘤細(xì)胞形成的多種自我保護(hù)機(jī)制如凋亡抵抗和免疫逃逸，使得惡性腫瘤的治療不易取得理想的效果。因此，找到新的、有效的治療手段是十分必要的。溶瘤病毒正是其中一種。溶瘤病毒是自然界中原本存在或通過(guò)基因工程人為改造的病毒，能夠選擇性感染并殺傷惡性腫瘤細(xì)胞，但對(duì)正常細(xì)胞幾乎不會(huì)產(chǎn)生副作用。常見(jiàn)的溶瘤病毒載體可以根據(jù)其核酸的類型，分為雙鏈DNA病毒(腺病毒，單純皰疹病毒)、雙鏈RNA病毒(呼腸孤病毒)、正鏈RNA病毒例(如薩奇病毒)以及包括麻疹病毒在內(nèi)的負(fù)鏈RNA病毒[2]。隨著對(duì)溶瘤病毒抗腫瘤機(jī)制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒能夠通過(guò)多種機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞，包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后直接裂解腫瘤細(xì)胞，激活凋亡通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，以及激活免疫細(xì)胞的成熟并促進(jìn)免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌，來(lái)觸發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答[3-4]。本篇綜述重點(diǎn)介紹溶瘤病毒如何通過(guò)誘導(dǎo)凋亡及激活免疫發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 溶瘤病毒通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用

1.1 腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)在基因?qū)用孢M(jìn)行控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡，而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)不同策略對(duì)抗凋亡[5]。例如通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)[6]，或通過(guò)突變和沉默凋亡相關(guān)基因p53，抑制促凋亡蛋白影響該基因所誘導(dǎo)的凋亡途徑[5]，惡性腫瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白及受體，如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)和腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體(TRAIL)的受體的缺失[7]，同樣會(huì)導(dǎo)致凋亡抵抗。這種對(duì)凋亡的抵抗能力，增加了惡性腫瘤的治療難度，而溶瘤病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)能力，使其能夠?qū)箰盒阅[瘤的凋亡抵抗。

1.2 溶瘤病毒通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡主要通過(guò)內(nèi)在途徑(線粒體通路)、外在途徑(死亡受體通路)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)十二指腸腺癌細(xì)胞被溶瘤病毒中的新城疫病毒感染后，細(xì)胞漿中的細(xì)胞色素C(CytC)水平明顯增高，且Caspase-9在感染早期被激活，這表明新城疫病毒能夠感染腫瘤細(xì)胞并通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。CytC能夠與細(xì)胞凋亡酶激活因子(Apaf1)和Caspase-9前體共同結(jié)合形成凋亡復(fù)合體。凋亡復(fù)合體能夠激活Caspase-9，而活化的Caspase-9進(jìn)一步誘導(dǎo)Caspase-3引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一過(guò)程是細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑即線粒體通路[9]。在乳腺癌中，新城疫病毒能夠使感染的乳腺癌細(xì)胞的Caspase-3和Caspase-9的基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的線粒體途徑是該溶瘤病毒殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一[7]。而另一種E1B 55-kDa基因缺失的溶瘤腺病毒被植入了熱休克蛋白輔助因子ST13基因后，被觀察到能夠引起結(jié)腸癌細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2的下調(diào)，并釋放CytC，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase-9和Caspase-3介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗[8]。

1.3 溶瘤病毒通過(guò)死亡受體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

溶瘤病毒除了通過(guò)線粒體途徑，還能夠通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的外部途徑誘導(dǎo)凋亡，這一途徑也被稱為死亡受體通路。是通過(guò)細(xì)胞外的死亡配體與死亡受體結(jié)合，將細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡。死亡受體是腫瘤壞死因子超家族的成員，死亡配體包括腫瘤壞死因子(TNF)、凋亡相關(guān)因子配體(FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體(TRAIL)，當(dāng)死亡配體與各自的死亡受體結(jié)合后能夠，使胞內(nèi)的死亡受體招募包含死亡域(DD)的銜接分子蛋白，并吸引Caspase-8前體，結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)，然后激活Caspase-8?；罨腃aspase-8使Caspase-3等效應(yīng)Caspase啟動(dòng)[9，12]。目前，已經(jīng)在多個(gè)感染了新城疫病毒的腫瘤細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)了Caspase-8蛋白的升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，死亡受體介導(dǎo)的凋亡可能發(fā)生在線粒體途徑之后[5]。此外，溶瘤痘苗病毒既可以通過(guò)線粒體通路也可以通過(guò)死亡受體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。近些年，隨著基因工程的不斷發(fā)展，通過(guò)改造野生型溶瘤病毒來(lái)增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性或使溶瘤病毒攜帶編碼抗腫瘤相關(guān)因子的基因成為了主要研究方向[15-16]。這種方式也被應(yīng)用于增強(qiáng)溶瘤病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。通過(guò)將攜帶了TRAIL基因的重組溶瘤腺病毒感染三陰性乳腺癌細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)，感染病毒的腫瘤細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)升高，并且細(xì)胞凋亡明顯增加[17]。此外，通過(guò)將TRAIL基因植入痘苗病毒，構(gòu)建的重組溶瘤痘苗病毒，同樣能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)TRAIL蛋白，當(dāng)分別將重組病毒和未植入TRAIL基因的痘苗病毒感染肺癌細(xì)胞后，檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)，這種方式靶向增強(qiáng)了重組病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[18]。這些結(jié)果表明溶瘤病毒能夠通過(guò)死亡受體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

1.4 溶瘤病毒通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是獨(dú)立于線粒體途徑和死亡受體途徑的又一誘導(dǎo)凋亡的主要途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)的激活可以促進(jìn)真核起始因子2α(eIF-2α)的磷酸化，而磷酸化的eIF-2α可以活化激活轉(zhuǎn)錄因子-4(ATF4)來(lái)激活C/EBP同源蛋白(CHOP)促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[19，20]。溶瘤病毒能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡同樣得到證實(shí)。新城疫病毒在感染腫瘤細(xì)胞后便會(huì)刺激eIF-2α激酶PERK的活化以及eIF-2α的磷酸化，并激活Caspase-12和Caspase-3來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還會(huì)引起位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的Caspase-12的表達(dá)，被激活的Caspase-12可以不用通過(guò)線粒體通路而直接觸發(fā)Caspase-9的活化[22]，最終激活Caspase-3。Jia等[23]的研究中發(fā)現(xiàn)痘苗病毒感染肝癌細(xì)胞后，Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12被激活的同時(shí)CHOP的表達(dá)明顯上調(diào)，一些抗凋亡蛋白表達(dá)減少，說(shuō)明痘苗病毒同樣可以通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

2 溶瘤病毒通過(guò)影響免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用

2.1 腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制

腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)增殖轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要原因是它能夠逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，稱為免疫逃逸。低突變負(fù)荷的腫瘤細(xì)胞傾向于產(chǎn)生較少的新抗原，使得他們更不容易被識(shí)別為外來(lái)抗原，形成低免疫原性[24]。即使腫瘤細(xì)胞表達(dá)了足夠的免疫原性抗原，但由于免疫識(shí)別依賴于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)暴露抗原的能力，而腫瘤細(xì)胞MHC表達(dá)減少或抗原提呈的缺陷，使腫瘤細(xì)胞得以避免被腫瘤特異性T細(xì)胞清除[25]。此外，腫瘤細(xì)胞還可以通過(guò)在體內(nèi)釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白介素-10和趨化因子等免疫抑制分子來(lái)構(gòu)建一個(gè)免疫抑制的微環(huán)境，保護(hù)腫瘤細(xì)胞[26]。近幾年發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)受體與配體的結(jié)合，能夠抑制T細(xì)胞功能，是免疫逃逸的又一重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)提高抑制性免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)，通過(guò)與T細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤能力，來(lái)躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。而溶瘤病毒，可以招募并活化免疫相關(guān)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞或腫瘤特異性T細(xì)胞等，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，同時(shí)還能影響免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)，來(lái)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.2 溶瘤病毒激活抗腫瘤免疫反應(yīng)

溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞后，會(huì)激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，一方面可以發(fā)揮長(zhǎng)期的抗腫瘤作用，另一方面，被激活的免疫系統(tǒng)，除了能夠殺傷被病毒感染的腫瘤細(xì)胞，還會(huì)識(shí)別并清除遠(yuǎn)處未被感染的腫瘤細(xì)胞。用痘苗病毒在治療胰腺癌小鼠模型后，腫瘤細(xì)胞周圍浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量也出現(xiàn)增加。在體外實(shí)驗(yàn)中，研究者觀察到，痘苗病毒可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DCs)和巨噬細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞朝著負(fù)責(zé)提呈抗原、發(fā)揮免疫監(jiān)視作用的具有抗腫瘤能力的M1型極化，表明痘苗病毒可以通過(guò)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞[27]。當(dāng)溶瘤病毒裂解腫瘤細(xì)胞后，裂解的細(xì)胞會(huì)釋放出病原相關(guān)分子模式(PAMPs)、損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)以及腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，這些物質(zhì)在溶瘤病毒啟動(dòng)抗腫瘤免疫的過(guò)程中都起到了關(guān)鍵作用。PAMPs包括病毒衣殼、病毒遺傳物質(zhì)和病毒復(fù)制過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，可以由DCs表面表達(dá)的模式識(shí)別受體(PRR)如toll樣受體(TLR)、NOD樣受體(NLR)識(shí)別[28]，PAMPs與PRR的結(jié)合會(huì)刺激DCs產(chǎn)生TNF-α、白介素-12等細(xì)胞因子[29]。這些細(xì)胞因子一方面可以招募并啟動(dòng)更多的自然殺傷細(xì)胞(NK)或DCs，另一方面還可以促進(jìn)DCs的成熟，使其進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子。DAMPs包括ATP、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)，由死亡、應(yīng)激或損傷的細(xì)胞分泌[30]。ATP相當(dāng)于一個(gè)“找到我”的信號(hào)可以招募DCs，CRT則相當(dāng)于一個(gè)“吃掉我”的信號(hào)，可以促進(jìn)細(xì)胞的吞噬，HMGB1則可以直接激活DCs[31]。被激活的成熟DCs會(huì)識(shí)別TAAs將其提呈并暴露給CD8+T細(xì)胞[32]，CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性可以通過(guò)直接釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)分泌TNF-α和白介素-2等細(xì)胞因子間接實(shí)現(xiàn)[33-34]。重組痘病毒CF33-hNIS-ΔF14.5也可以在乳腺癌小鼠模型中進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周圍CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)[35]。溶瘤病毒因此成為抗腫瘤免疫治療中極具潛力的治療方式。

2.3 溶瘤病毒增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)的抗腫瘤能力

免疫檢查點(diǎn)是一組位于細(xì)胞表面、能夠調(diào)節(jié)免疫的分子，可以促進(jìn)或抑制免疫細(xì)胞的功能。免疫檢查點(diǎn)受體中的程序性死亡受體1(PD-1)位于活化的CD8+T細(xì)胞表面。正常情況下，CD8+T細(xì)胞(也稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，CTLs)通過(guò)抗原提呈細(xì)胞(APC)提呈的抗原識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞會(huì)上調(diào)免疫檢查點(diǎn)配體PD-L1的表達(dá)[36]。PD-1與PD-L1結(jié)合，會(huì)抑制T細(xì)胞的遷移、增殖和分泌，并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡和功能衰竭，從而阻斷腫瘤免疫循環(huán)[37-38]。PD-1/PD-L1抑制劑正是針對(duì)這一機(jī)制發(fā)揮作用，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PD-1受體和PD-L1配體，阻止PD-1與PD-L1的結(jié)合，促進(jìn)免疫監(jiān)視，抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。但由于許多惡性腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平較低，同時(shí)腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞較少，是所謂的“冷腫瘤”[39]，免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)這類腫瘤的治療效果非常有限。免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)“熱腫瘤”的治療效果相比于“冷腫瘤”更為顯著[36，40]，而溶瘤病毒對(duì)免疫細(xì)胞的激活恰好可以將“冷腫瘤”加熱成為“熱腫瘤”[41-42]。在Mostafa等[43]的研究中，發(fā)現(xiàn)呼腸弧病毒能夠誘導(dǎo)PD-L1在人和小鼠乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，從而提高免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效果。溶瘤病毒與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的協(xié)同抗腫瘤作用存在于多種溶瘤病毒中[44]，包括單純皰疹病毒[45]和腺病毒[46]等。此外，通過(guò)溶瘤病毒攜帶并表達(dá)目的基因，能夠改變腫瘤免疫微環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)。白介素-12能夠啟動(dòng)固有免疫和適應(yīng)性免疫，而白介素-7可以協(xié)同白介素-12刺激T細(xì)胞的活化。利用能夠編碼白介素-7和白介素-12的溶瘤痘苗病毒，能夠增加腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，改變免疫微環(huán)境，增強(qiáng)溶瘤病毒激活抗腫瘤免疫的能力，同時(shí)上調(diào)PD-L1的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的敏感性的增加[47]。溶瘤病毒對(duì)免疫檢查點(diǎn)的影響，使得溶瘤病毒和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合治療可能會(huì)成為未來(lái)臨床應(yīng)用的主要方式。

3 小結(jié)與展望

溶瘤病毒由于具備對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性感染和直接殺傷作用，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和激活抗腫瘤免疫的激活能力，成為腫瘤免疫治療的熱門研究方向。目前，已經(jīng)有溶瘤病毒藥物被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，Oncorine(H101)是中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2005年批準(zhǔn)用于治療頭頸部腫瘤的重組溶瘤腺病毒[48]，美國(guó)食品和藥物管理局在2015年批準(zhǔn)一種溶瘤單純皰疹病毒-Talimogene laherparepvec(T-VEC)應(yīng)用于治療皮膚和淋巴結(jié)的黑色素瘤[49]，這也充分證實(shí)了溶瘤病毒作為治療惡性腫瘤藥物的臨床可行性。溶瘤病毒與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用取得的效果，也使得溶瘤病毒相關(guān)的聯(lián)合治療成為了更具前景的方式，因此溶瘤病毒除了聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，聯(lián)合放療、化療，甚至兩種以上治療方式的聯(lián)合應(yīng)用都是未來(lái)研究的方向。但溶瘤病毒作為一種新的輔助治療方式，它的機(jī)會(huì)窗暫時(shí)還不明確。術(shù)前應(yīng)用溶瘤病毒確實(shí)能夠提供一個(gè)長(zhǎng)期的抗腫瘤免疫來(lái)預(yù)防復(fù)發(fā)和限制轉(zhuǎn)移[50]，但是術(shù)前應(yīng)用是否優(yōu)于術(shù)后應(yīng)用仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊芰霾《緸閻盒阅[瘤治療建立了一個(gè)新的平臺(tái)，成為了腫瘤治療過(guò)程中對(duì)抗腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗和免疫逃逸的新治療方式。