梔子花提取物的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

徐 禎，毛春芹,2，顧 薇,2，毛 靖，蘇聯(lián)麟，李 林，皮文霞*，陸兔林,2*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)；2江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，南京 210023

梔子花是茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis和重瓣梔子GardeniajasminoidesEllis var.fortuniana(Lindl.)Hara的干燥花，收錄于《中華本草》[1]《中藥大辭典》[2]等書籍，其味苦、性寒，入藥具有清肺止咳、涼血止血的作用。梔子花食用、藥用、妝用歷史悠久，《滇南本草》[3]言其可“止肺熱咳嗽，止鼻衄血，消痰”；《千金翼方》[4]《本草綱目》[5]均稱其可“悅顏色”。現(xiàn)代研究表明梔子花含有精油、三萜類、黃酮類、酚酸類、生物堿類等多種成分[6-8]。梔子花氣味芳香，從中提取的精油具有舒緩身心、抗焦慮[9]等作用，但因含量少、難以提取而極其珍貴；研究表明梔子花及其精油能夠清除多種自由基[6,10]，具有良好的抗氧化美容效果。黃酮類物質(zhì)是具有較強(qiáng)抗氧化功效的植物活性成分。梔子花與常用中藥材梔子來源自同一植物，種植廣泛、資源豐富，其提取物目前已收錄于《化妝品已使用原料目錄》2021年版中，但由于研究較少，國內(nèi)對梔子花的利用率不高，也造成了梔子花資源的大量浪費(fèi)。

植物精油的傳統(tǒng)提取方法為水蒸氣蒸餾法，這種方法設(shè)備簡單，但提取率低，容易導(dǎo)致提取的精油香味不純正[11]。超臨界CO2萃取法[12,13]是一種以CO2流體為溶劑、從混合物中分離出組分的提取方法，這種方法與水蒸氣蒸餾法相比提取效率高，能夠更加有效保存精油的天然香味，且CO2可回收、無毒，不會產(chǎn)生浪費(fèi)和污染。有文獻(xiàn)報道[12]，采用這種提取方法得到的梔子花精油沒有受到水蒸氣的高溫影響，一些易揮發(fā)的芳香成分保留了下來，具有鮮梔子花的特征香氣。除此之外，也有研究[14,15]對梔子花中黃酮類成分的提取工藝進(jìn)行了考察。由于精油和黃酮都是植物中生物活性較強(qiáng)的大類成分，且應(yīng)用范圍廣泛，將這兩種成分進(jìn)行綜合提取在多種中藥和含有精油的植物中已有應(yīng)用，如紫花地丁[16]、枇杷花[17]、玫瑰[18]、薰衣草[19]等。目前對梔子花精油(Gardeniajasminoidesflower essential oil，GJFEO)或梔子花總黃酮類提取物(Gardeniajasminoidesflower flavonoids extract，GJFFE)的提取均為以梔子花為原料進(jìn)行單一提取，對梔子花展開綜合性深加工研究、可以提高梔子花的利用率，為中藥非藥用部位資源的開發(fā)利用提供參考。

經(jīng)文獻(xiàn)報道，GJFEO在體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)中對DPPH、ABTS及OH自由基都有較好的清除作用[6,10]，植物黃酮也是天然抗氧化活性成分研究中的一大熱點(diǎn)[20]。目前梔子花細(xì)胞水平和動物水平的抗氧化活性研究較少，對梔子花進(jìn)行更深入的藥理活性研究可以為相關(guān)抗氧化化妝品及日用產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。本研究將對梔子花中精油和總黃酮成分的綜合提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對梔子花的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期解決以上問題，并為中藥非藥用部位的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

梔子花購買自浙江溫州，批號20200520，干燥方式為陰干。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥花。

蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號YM0313SA14)；沒食子酸對照品(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度99%，批號20200408)；福林酚試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma-Aldrich公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海九億化學(xué)試劑有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；胎牛血清(美國Invigentech公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；無菌PBS(博士德生物科技有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80型高速萬能粉碎機(jī)(天津布泰斯特儀器有限公司)；FA1104型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DY221-50-06型超臨界CO2萃取裝置(海安宏麥機(jī)械有限公司)；HH-S4型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；SW-CJ-1F型潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；3131型二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板(美國 Corning公司)；CKX31型顯微鏡(南京奧力科學(xué)儀器有限公司)；Infinite M200PRO型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.3 細(xì)胞株

人永生化角質(zhì)形成(HaCaT)細(xì)胞(上海富衡生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 梔子花精油的提取工藝研究

1.4.1.1 單因素試驗(yàn)

本研究首先采用超臨界CO2流體萃取法對梔子花進(jìn)行提取，該方法不僅提取率高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，且方便梔子花殘渣的進(jìn)一步提取利用。參數(shù)設(shè)置參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，以精油得率為指標(biāo)，分別對萃取溫度(30、35、40、45 ℃)、萃取壓力(15、20、25、30、35 MPa)、分離壓力(8、10、12、14 MPa)進(jìn)行單因素考察。將干梔子花粉碎后過50目篩，取100 g梔子花粉末裝入超臨界流體萃取裝置，設(shè)置萃取溫度、萃取壓力、分離壓力，分離溫度為35 ℃，萃取1 h后打開分離釜閥門收集GJFEO。

1.4.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對超臨界CO2萃取法萃取GJFEO的工藝進(jìn)一步優(yōu)化，因素水平考察指標(biāo)如表1所示。

表1 GJFEO提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels analysis of orthogonal test of GJFEO extraction process

1.4.2 梔子花總黃酮提取物的提取工藝研究

1.4.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總黃酮的顯色及測定參考文獻(xiàn)方法[14]。精密吸取質(zhì)量濃度為100.1 μg/mL的蘆丁對照品溶液2.0、2.5、3.0，3.5、4.0、4.5、5.0 mL，分別加入到10 mL容量瓶中，加70%乙醇2 mL，混勻，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，混勻靜置5 min，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，混勻靜置6 min，加入4%氫氧化鈉4 mL，混勻靜置15 min，用70%乙醇定容至刻度，搖勻；用同樣的方法制備空白對照。在507 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸。

1.4.2.2 單因素試驗(yàn)

收集萃取精油后的梔子花粉末殘渣提取其中的總黃酮類物質(zhì)可提高梔子花的利用率。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，以乙醇為溶劑對梔子花殘渣進(jìn)行超聲提取，以總黃酮提取率為指標(biāo)，對乙醇濃度(50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取時間(20、30、40、50 min)、提取次數(shù)(1、2、3次)進(jìn)行單因素考察，確定GJFFE的最佳提取工藝。GJFFE的提取步驟如下。

稱取提取完精油的梔子花粉末殘渣10 g，加入不同濃度乙醇超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取，合并提取液，過濾后得到濾液，濃縮至50 mL得到梔子花總黃酮提取液，提取液蒸干可得到浸膏，即為GJFFE。GJFFE用50%乙醇溶解后定容至50 mL，參照“1.4.2.1”中總黃酮的顯色方法進(jìn)行顯色和測定，總黃酮的提取率計算公式見式(1)：

(1)

1.4.3 梔子花復(fù)合提取物的制備

將同一份梔子花樣品中所得到的GJFEO和GJFFE稱重，得到兩種提取物的質(zhì)量比。按照此質(zhì)量比配制得到梔子花復(fù)合提取物(Gardeniajasminoidesflower compound extract，GJFCE)。

1.4.4 梔子花提取物對HaCaT細(xì)胞的毒性

取GJFEO、GJFFE、GJFCE，用含1% DMSO的DMEM培養(yǎng)基配制稀釋成不同濃度的藥液。

取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，稀釋至7×104個/mL后，每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；棄舊培養(yǎng)液，以不同濃度的GJFEO(50.00～1 000.00 μg/mL)、GJFFE(50.00～1 000.00 μg/mL)、GJFCE(10.42～833.33 μg/mL)給藥，同時設(shè)置空白組、陽性組(SDS濃度為0.01 mg/mL)、調(diào)零組，每組設(shè)定5個復(fù)孔，孵育24 h；棄舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，避光條件下，每孔再加入20 μL MTT溶液(0.05 mg/mL)，孵育4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各孔的吸光度A，按式(2)計算各組細(xì)胞相對存活率，用Graphpad Prism 7軟件處理數(shù)據(jù)并計算IC50。

(2)

1.4.5 三種提取物對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

按照以下步驟先分別比較GJFEO、GJFFE和GJFCE不同濃度下的抗氧化活性，再選出各自效果最佳的濃度進(jìn)行比較。

取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，稀釋至7×104個/mL后，每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)，孵育24 h；棄去舊培養(yǎng)液，以不同濃度的GJFEO(12.50～100.00 μg/mL)、GJFFE(20.00～320.00 μg/mL)、GJFCE(2.09～133.44 μg/mL)給藥，同時設(shè)置空白組、陽性組(Vc濃度為0.008 mg/mL)、模型組、調(diào)零組，每組設(shè)定5個復(fù)孔，孵育24 h；除空白組和調(diào)零組外，每孔加50 μL H2O2(終濃度0.8 mmol/L)，孵育4 h；棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，避光條件下，每孔再加入20 μL MTT溶液，孵育4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各孔的吸光度A，按式(2)計算各組細(xì)胞相對存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GJFEO的提取工藝研究

2.1.1 萃取溫度對GJFEO得率的影響

設(shè)置萃取壓力為20 MPa，分離壓力為10 MPa，在30～45 ℃范圍內(nèi)考察萃取溫度對梔子花精油得率的影響。由圖1A可知，精油得率隨著萃取溫度變化而變化，當(dāng)萃取溫度在30～40 ℃之間時，精油得率較高，萃取溫度為40 ℃，最高可達(dá)0.81%；此時萃取溫度再升高，精油得率反而下降。原因可能為恒定壓力下，CO2密度隨溫度的升高而降低，而溫度對溶質(zhì)的溶解度同樣具有一定影響。這種影響程度除實(shí)驗(yàn)外目前還不可預(yù)測[21]。因此根據(jù)本研究結(jié)果，確定40 ℃為最佳萃取溫度。

2.1.2 萃取壓力對GJFEO得率的影響

設(shè)置萃取溫度為45 ℃，分離壓力為10 MPa，在15～35 MPa范圍內(nèi)考察萃取壓力對梔子花精油得率的影響。由圖1B可知，精油得率隨萃取壓力的增大有升高趨勢，當(dāng)萃取壓力為30 MPa時最高，達(dá)到了1.14%，此時繼續(xù)增大萃取壓力，精油得率則會開始下降，原因可能是超臨界狀態(tài)下，壓力和溫度對萃取效果產(chǎn)生的交互影響較大。大多數(shù)情況下，隨壓力的增大，脂溶性物質(zhì)的提取率會相應(yīng)升高，但速率會減慢；且溶出的物質(zhì)種類會增加。在超臨界流體萃取法中，萃取的效果往往取決于萃取壓力和溫度的共同作用，其中萃取壓力產(chǎn)生的影響更大[21]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇30 MPa為最佳萃取壓力。

2.1.3 分離壓力對GJFEO得率的影響

當(dāng)流體狀的CO2攜帶精油進(jìn)入分離釜時，壓力降低使得CO2與精油分離。設(shè)置萃取溫度為45 ℃，萃取壓力為20 MPa，在8～14 MPa范圍內(nèi)考察分離壓力對GJFEO得率的影響。由圖1C可知，GJFEO的得率隨著分離壓力的升高而升高。當(dāng)分離壓力為14 MPa時，精油得率最高，為1.06%，因此選擇14 MPa為最佳分離壓力。

圖1 GJFEO提取工藝的單因素考察Fig.1 Single factors investigation of GJFEO extraction process

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素考察的結(jié)果設(shè)置正交試驗(yàn)的因素水平，對GJFEO的提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析如表2、3所示，由此可知，在本研究中，萃取溫度對梔子花精油得率的影響最大，其次是萃取壓力，分離壓力的影響最小。因此超臨界流體萃取法提取GJFEO的最佳工藝根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇萃取溫度為38 ℃，萃取壓力為32 MPa，分離壓力則選擇能耗較少的12 MPa。

表2 GJFEO提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of GJFEO extraction process

2.2 GJFFE的提取工藝研究

2.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在507 nm波長處測定不同濃度蘆丁對照品溶液顯色后的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y= 13.487X- 0.109 4，r= 0.999 6，表明總黃酮在20.02 ～ 50.05 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 GJFEO提取工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 3 The analysis of variance of orthogonal test of GJFEO extraction process

2.2.2 乙醇濃度對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花分別用50%、60%、70%、80%的乙醇，按液料比20∶1進(jìn)行提取，每次30 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結(jié)果如圖2A所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而降低，說明較低濃度的乙醇有利于黃酮類成分的溶出。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇50%為最佳乙醇濃度。

2.2.3 液料比對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花用60%乙醇，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1進(jìn)行提取，每次30 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結(jié)果如圖2B所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著液料比的增大而緩慢升高，說明在10∶1～25∶1的液料比范圍內(nèi)，液料比對梔子花殘渣中總黃酮成分提取的影響不大。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇25∶1為最佳液料比。

2.2.4 提取時間對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花用60%乙醇，按液料比20∶1進(jìn)行提取，提取時間分別為每次20、30、40、50 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結(jié)果如圖2C所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著每次提取時間的增長而升高，當(dāng)提取時間為50 min時提取效果最好，此時總黃酮提取率2.05%。因此選擇50 min為每次的提取時間。

2.2.5 提取次數(shù)對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花分別用60%乙醇，按液料比20∶1進(jìn)行提取，每次30 min，各提取1、2、3次，測定并計算總黃酮的提取率。結(jié)果如圖2D所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著提取次數(shù)的增大而升高，提取2次的提取率比提取1次顯著升高，但當(dāng)提取次數(shù)為3次時，升高幅度不大，為提高效率節(jié)約能源，選擇提取次數(shù)為2次。

圖2 GJFFE提取工藝的單因素考察Fig.2 Single factors investigation of GJFFE extraction process

2.3 梔子花復(fù)合提取物的制備

在同一份梔子花樣品中提取得到的GJFEO質(zhì)量為1.07 g、GJFFE質(zhì)量為23.79 g，質(zhì)量比約為1∶24。將GJFEO和GJFFE按照此比例進(jìn)行復(fù)配可以最大程度地利用兩種提取物。因此從提高梔子花原料利用度的角度出發(fā)，將GJFEO和GJFFE按質(zhì)量比1∶24復(fù)配制得GJFCE。

2.4 梔子花提取物對HaCaT細(xì)胞的毒性

角質(zhì)形成細(xì)胞是人類表皮組織中最主要的細(xì)胞群，占95%。HaCaT細(xì)胞是研究外用藥物制劑及化妝品對皮膚安全性及有效性時的首選細(xì)胞。SDS是一種陰離子表面活性劑，運(yùn)用于化妝品、日化用品中，對人體有微毒，常被用于測定皮膚刺激性的實(shí)驗(yàn)。以SDS為陽性藥，采用MTT法分別測定給藥后的細(xì)胞相對存活率，以IC50的大小來反映梔子花精油、梔子花黃酮提取物和復(fù)合提取物的對HaCaT細(xì)胞的毒性，結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知，梔子花精油和黃酮提取物對皮膚細(xì)胞的毒性較小，但二者按比例復(fù)配后毒性顯著增大。

2.5 梔子花提取物對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

氧化損傷是公認(rèn)的造成皮膚衰老的主要原因之一。H2O2是一種活性氧，具有強(qiáng)氧化性，使用H2O2作為誘導(dǎo)劑可以模擬出較為真實(shí)的皮膚氧化損傷情況?？箟难?Vc)是常用的抗氧化劑，0.008 mg/mL即可發(fā)揮作用，且作用較顯著。首先考察不同濃度下的GJFEO、GJFFE的抗氧化活性，分別篩選出效果最好的濃度后和GJFCE進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4A、4B所示?？芍?dāng)濃度在12.50～50.00 μg/mL之間時，GJFEO組和模型組相比具有顯著的抗氧化作用(P<0.01)，且效果優(yōu)于Vc組；當(dāng)濃度在20.00～160.00 μg/mL之間時，GJFFE組和模型組相比具有抗氧化作用，當(dāng)濃度為20 μg/mL時，具有顯著的抗氧化活性(P<0.001)且效果優(yōu)于Vc組。細(xì)胞的相對存活率隨著GJFEO和GJFFE的濃度升高而降低，原因是這兩種提取物均具有一定的細(xì)胞毒性，濃度升高，細(xì)胞毒性也增大。由圖4C可知，當(dāng)濃度在2.09～16.68 μg/mL范圍內(nèi)，GJFCE組和模型組相比具有顯著的抗氧化活性(P<0.05)，且優(yōu)于Vc組。GJFCE組發(fā)揮抗氧化活性的濃度明顯低于GJFEO組和GJFFE組，當(dāng)濃度為4.17 μg/mL時，GJFCE組抗氧化活性最佳。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選，GJFEO、GJFFE和GJFCE抗氧化效果最好的濃度分別為25、20、4.17 μg/mL。將這三種效果最好濃度的提取物進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4D顯示，4.17 μg/mL的GJFCE的抗氧化效果優(yōu)于單一使用的GJFEO或GJFFE(P<0.001)，且此時GJFCE中的GJFEO、GJFFE的占比濃度僅為0.17、4.00 μg/mL，遠(yuǎn)低于此組實(shí)驗(yàn)中兩種單一提取物的濃度，因此表明將GJFEO和GJFFE按比例復(fù)配后可明顯提高抗氧化活性。

圖4 梔子花不同提取物抗H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用比較Fig.4 The protective effect of different extracts from Gardenia jasminoides flower against oxidative damage induced by H2O2 in HaCaT cells注：與空白組比較， ***P<0.001；與模型組相比，與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與GJFCE組相比，△△△P<0.001。 Note:Compared with the blank group, ***P<0.001;Compared with the model group, #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;Compared with the GJFCE group,△△△P<0.001.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GJFEO、GJFFE復(fù)配后細(xì)胞毒性增大，抗氧化作用明顯增強(qiáng)，二者可能是產(chǎn)生了協(xié)同增效作用。Zhu等[16]對紫花地丁的相關(guān)研究同樣發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油和黃酮類成分在清除DPPH自由基上能產(chǎn)生協(xié)同作用，但機(jī)制尚不明確。植物精油發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制主要為降低自由基水平和調(diào)控影響細(xì)胞凋亡的蛋白基因兩個方面[22]，如薰衣草精油[23]、花椒精油[24]可抑制或清除體內(nèi)多種自由基、提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞凋亡的多種蛋白基因等。植物黃酮抑制機(jī)體脂質(zhì)過氧化的機(jī)制和精油相似[25]，如楊梅黃酮[26]可以提高SOD活性，提高IKBA mRNA表達(dá)量、抑制MMP-1 mRNA水平的升高；葛根素[27]對UVA損傷的HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用可能與激活Keap1/Nrf2信號通路上調(diào)抗氧化酶活性和下調(diào)IL-1β、Fas有關(guān)；補(bǔ)骨脂異黃酮[28]同樣可能通過下調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)、提高抗氧化酶活性來保護(hù)皮膚細(xì)胞。綜上所述，植物精油和黃酮都是通過提高抗氧化酶的活性、調(diào)控抑制細(xì)胞凋亡的蛋白基因等方式來發(fā)揮抗氧化作用，二者作用途徑高度相似，可能是其復(fù)合時發(fā)揮協(xié)同增效作用的機(jī)制之一。GJFCE的抗氧化活性增強(qiáng)的同時其細(xì)胞毒性也相應(yīng)升高，但其產(chǎn)生明顯抗氧化活性的濃度在其IC50范圍內(nèi)，表明GJFCE在發(fā)揮抗氧化作用時對細(xì)胞的損傷仍然較小。

3 結(jié)論

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了GJFEO的最佳提取工藝為萃取溫度38 ℃、萃取壓力32 MPa、分離壓力12 MPa；采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了GJFFE的最佳提取工藝為乙醇濃度50%、液料比25∶1、提取時間50 min、共提取2次。兩種工藝均條件簡單、操作方便，一方面避免了精油傳統(tǒng)提取過程中加熱的操作，克服了蒸餾法精油香味不純正、提取率低的缺陷；另一方面對提取完精油的殘渣進(jìn)行再次提取，能夠獲得其中的總黃酮成分，提高了梔子花原料的利用率。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GJFEO、GJFFE、GJFCE均對H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，且GJFEO與GJFFE復(fù)合后能夠產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，提示GJFCE可作為一種高抗氧化性的梔子花提取物進(jìn)行開發(fā)或深入的機(jī)制研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中GJFEO和GJFFE在梔子花中所占質(zhì)量比為1∶24，本文中研究的GJFCE從提高原料利用率的角度考慮按照此比例進(jìn)行復(fù)配，后期可對不同比例復(fù)配的GJFCE進(jìn)行進(jìn)一步的活性評價以優(yōu)選最佳比例。目前由于開發(fā)技術(shù)的薄弱，梔子花資源存在大量浪費(fèi)，本研究的結(jié)果可為梔子花相關(guān)抗氧化化妝品及日化用品的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，為中藥非藥用部位的綜合利用提供借鑒及參考。