硫酸銨在蛋白質(zhì)含量測定中的參比作用初探

王亞棋 黎雋 劉立科等

【摘要】目的 中國藥典2010版附錄Ⅶ D 氮測定法第二法，是蛋白質(zhì)含量測定的經(jīng)典方法。但參考蛋白難于獲得，檢測結(jié)果缺乏參比性。本文嘗試以分析純硫酸銨為參考品，檢測關(guān)節(jié)軟骨再生支架樣品中的蛋白質(zhì)含量。方法 分別稱取三份硫酸銨，與蛋白樣品一起，在相同條件下測試其回收率，用以參照評價(jià)蛋白樣品的檢測結(jié)果。結(jié)果 硫酸銨的回收率接近100%，不考慮消化樣品的差異，可以確認(rèn)樣品測定結(jié)果。 結(jié)論 在沒有標(biāo)準(zhǔn)蛋白作參比的情況下，在凱氏定氮法中引入硫酸銨，可以很好的監(jiān)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)；測定；硫酸銨

【中圖分類號】R151.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0011-01

蛋白質(zhì)是由氨基酸以酰胺鍵（ 肽鍵） 相結(jié)合形成的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的高分子化合物， 是生物體中的主要含氮物質(zhì)。蛋白質(zhì)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和遺傳等密切相關(guān)， 蛋白質(zhì)的定量測定是生物化學(xué)和其他生物科學(xué)、食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、疾病診斷和質(zhì)量檢驗(yàn)中最重要的工作。蛋白質(zhì)測定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進(jìn)行推算蛋白質(zhì)含量的方法。直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)， 直接測定蛋白質(zhì)含量的方法。多年來， 利用蛋白質(zhì)的主要性質(zhì)（ 如含氮量、肽鍵、折射率等） 和利用蛋白質(zhì)含有的特定氨基酸殘基（ 如芳香基、酸性基、堿性基等） ， 測定蛋白質(zhì)的方法不斷發(fā)展， 主要有凱氏定氮法（ 國際經(jīng)典測定方法） 、分光光度法、電化學(xué)法、滴定法、高壓液相色譜法、電泳法、免疫法等[1]。蛋白質(zhì)是食品中的重要營養(yǎng)成分，也是評價(jià)食品營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一[2]，隨著科學(xué)技術(shù)的向前發(fā)展，蛋白質(zhì)被引入到很多醫(yī)療器械中，并成為評價(jià)該醫(yī)療器械質(zhì)量的重要指標(biāo)。在運(yùn)用凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量時(shí)，常常沒有合適的標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白，而且在不同參考蛋白模式下得到的評價(jià)差距較大，在作為蛋白質(zhì)生物價(jià)的估計(jì)時(shí)不夠理想和滿意[3]。為此。我們選用硫酸銨作對照，起到了一定的參比作用。

凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾和吸收、滴定等過程。在催化劑作用下， 試樣用濃硫酸消煮破壞有機(jī)物， 使其中的蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮， 然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出， 用硼酸吸收后， 再用酸滴定， 測出含氮量， 將結(jié)果乘以換算系數(shù)， 計(jì)算出粗蛋白質(zhì)含量[4-6] 。它是測定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。通常認(rèn)為該法關(guān)鍵環(huán)節(jié)有濃硫酸用量、催化劑選擇、消化時(shí)間、氫氧化鈉用量和硼酸吸收液指示劑選擇等[1]。但在我們的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，在用標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液進(jìn)行滴定時(shí)，特別是在使用全自動點(diǎn)位滴定儀時(shí)，終點(diǎn)的選取也很關(guān)鍵。這時(shí)選用合適的參照品就很重要了。為此，我們就用硫酸銨解決了這一問題。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)器材：

半微量法凱氏定氮儀、50ml凱氏燒瓶、移液管、滴定管、錐形瓶、試管、電子萬用爐、容量瓶、電子天平

2.試劑：

關(guān)節(jié)軟骨再生支架、分析純硫酸銨、稀硫酸、甲基紅指示液、30%硫酸銅溶液、2%硼酸溶液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示液、40%氫氧化鈉溶液、0.05mol/L硫酸滴定液、0.005mol/L硫酸滴定液、硫酸鉀、硫酸

3.試驗(yàn)步驟：

按照《中華人民共和國藥典2010年版二部》附錄Ⅶ D 氮測定法第二法所示，連接蒸餾裝置，在1000mL圓底燒瓶A中加水適量（約500mL）和甲基紅指示液8滴，再加稀硫酸使成酸性，加沸石5粒，從漏斗D中加水約50mL，關(guān)閉漏斗與連有氮?dú)馇虻恼麴s器之間的橡皮管夾。開放冷凝水，煮沸1000mL圓底燒瓶A中的水，當(dāng)蒸汽從冷凝管尖端冷凝而出時(shí)，移去火源，關(guān)閉1000mL圓底燒瓶A與安全瓶連接的橡皮管夾，使連有氮?dú)馇虻恼麴s器中的水反抽到安全瓶，放開與漏斗連接的橡皮管夾，放出安全瓶中的水，關(guān)閉安全瓶與漏斗連接的橡皮管夾，將冷凝管尖端插入約50mL水中，使水自冷凝管尖端反抽至連有氮?dú)馇虻恼麴s器瓶C，再抽至安全瓶B中，如上法放去。如此將儀器內(nèi)部洗滌3次。

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別取供試品和對照品適量（約相當(dāng)于含氮量1.0～2.0mg），精密稱定，置干燥的50mL凱氏燒瓶中。加硫酸鉀0.3g與30%硫酸銅溶液5滴，再沿甁壁滴加硫酸2.0mL；在凱氏燒瓶口放一小漏斗，并使凱氏燒瓶成45°斜置，用小火緩緩加熱使溶液保持在沸點(diǎn)以下，等泡沸停止，逐步加大火力，沸騰至溶液成澄明的綠色后，繼續(xù)加熱10分鐘，放冷，加水2mL。

取2%硼酸溶液10mL，置100mL錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管尖端插入液面下。然后，將凱氏燒瓶中內(nèi)容物經(jīng)由漏斗轉(zhuǎn)入連有氮?dú)馇虻恼麴s器C中，用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗三次，再加入40%氫氧化鈉溶液10mL，用少量水再洗漏斗三次。關(guān)閉漏斗與連有氮?dú)馇虻恼麴s器之間的橡皮管夾，加熱1000mL的圓底燒瓶A進(jìn)行蒸氣蒸餾，至硼酸液開始由酒紅色變?yōu)樗{(lán)綠色時(shí)起，繼續(xù)蒸餾約10分鐘后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣繼續(xù)沖洗約1分鐘，用水淋洗尖端后停止蒸餾。

結(jié) 果

取餾出液用0.005mol/L的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙⒌味ǖ慕Y(jié)果用空白試驗(yàn)校正。下表為檢測結(jié)果。不論是樣品還是對照品硫酸銨，都得出了平行性較好的結(jié)果。具有一定的可信度。

計(jì)算公式：

6.25---氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)；

討 論

針對實(shí)驗(yàn)室在檢測檢驗(yàn)過程中缺乏蛋白質(zhì)權(quán)威計(jì)量方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及校準(zhǔn)規(guī)范造成蛋白質(zhì)相關(guān)醫(yī)療器械無法檢定校準(zhǔn)的問題，著重進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和分子量權(quán)威計(jì)量方法研究、檢定校準(zhǔn)用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制以及蛋白質(zhì)相關(guān)醫(yī)療器械校準(zhǔn)規(guī)范起草工作，非常必要。在此之前，利用凱氏定氮法的相關(guān)原理，引入硫酸銨等作為對照，可以增加檢測檢驗(yàn)結(jié)果的信心。

樣品在消化時(shí)加入濃硫酸的量必須過量。 一是脫水作用， 將樣品中有機(jī)物脫水然后碳化成C；二是氧化作用， 濃硫酸和硫酸鉀、硫酸銅一同加熱使溫度達(dá)到400攝氏度以上， 碳還原硫酸生成SO2，而碳本身被氧化成CO2；三是分解作用， 將蛋白質(zhì)分解， SO2 還原N生成銨根離子NH+4 ， 本身被氧化成SO3；四是吸收作用， 生成的銨根離子NH+4與濃硫酸反應(yīng)生成硫酸銨（NH4）2SO4；五是生成的（NH4）2SO4保存在濃硫酸溶液中不至于損失[ 5， 7] 。樣品消化過程要加入催化劑， 加入硫酸鉀能夠提高分解時(shí)溶液的溫度， 使溶液沸點(diǎn)由290 攝氏度提高到400攝氏度。加入硫酸銅、氧化汞和硒粉則能促進(jìn)試樣的分解， 縮短消化時(shí)間。有試驗(yàn)證明， 用硒粉作催化劑可加快消化速率， 縮短試樣消化時(shí)間， 其測定結(jié)果與硫酸銅作為催化劑的傳統(tǒng)方法相當(dāng)吻合[8] ， 但硒粉使用量過多或與硫酸作用時(shí)間過久會使銨態(tài)氮成為分子氮而損失[9] 。雖然加入氧化汞能夠節(jié)省消化時(shí)間， 但由于污染較重， 多用于仲裁檢驗(yàn)[8]。目前包括國標(biāo)方法大多加入硫酸鉀和硫酸銅混合催化劑，但眾多文獻(xiàn)中二者用量的比例有所不同， 硫酸鉀B硫酸銅比例主要有15：1、10：1、10：0.9 和9：1等[ 2- 3， 8- 9] ， 國標(biāo)方法采用10：1比例， 硫酸銅用量是影響消化時(shí)間的主要因素[10] 。樣品消化過程中， 消化液經(jīng)過一系列改變最終轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色透明狀態(tài)， 這種過程是碳化的有機(jī)物完全被氧化的變化， 但決不表示樣品中的氮素全部轉(zhuǎn)變?yōu)镹H+4 。蒸餾過程中加入40%氫氧化鈉溶液， 用于中和樣品消化后剩余的濃硫酸， 并使（NH4）2SO4轉(zhuǎn)化為NH4OH， 經(jīng)加熱生成NH3逸出， 被硼酸吸收。為使樣品消化液中的（NH4）2SO4全部轉(zhuǎn)化為NH4OH，40% 氫氧化鈉溶液必須過量加入， 用量不夠會造成測定結(jié)果偏低， 用量過多則浪費(fèi)試劑[6] 。硼酸吸收液中混合指示劑的組成和配方有數(shù)種， 如溴甲酚綠- 甲基紅、甲基紅- 甲基藍(lán)、甲烯藍(lán)- 甲基紅等， 但以0.5%溴甲酚綠乙醇溶液和0.1%甲基紅乙醇溶液混合而成的混合指示劑變色比較敏感。指示劑與硼酸吸收液的比例通常使用1：100或2：100。雖然，以硫酸銨作為對照，不能表示蛋白消化游離出氮的程度，卻可以較好監(jiān)測后續(xù)的實(shí)驗(yàn)狀況。

考慮到硫酸與碳酸鈉的反應(yīng)有兩個不同的終點(diǎn)：2Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+2NaHCO3，Na2CO3+H2SO4=Na2SO4+H2O+CO2↑，標(biāo)定硫酸時(shí)要注意選擇合適的指示劑和對應(yīng)的反應(yīng)式進(jìn)行計(jì)算。特別是利用全自動電位滴定儀進(jìn)行標(biāo)定時(shí)，如果選用標(biāo)準(zhǔn)方法[11]，采取硫酸去滴定碳酸鈉時(shí)，要注意選用硫酸的物質(zhì)的量的基本單元是[c（1/2H2SO4）]而非[c（H2SO4）]。

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