腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Glu、NMDA—R1的影響

杜培坤　李妍怡　王艷玲

摘要：目的：探討腦心通對缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護機制。方法：采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察大鼠腦組織中Glu含量及大鼠海馬組織NMDA-R1表達數(shù)量的變化。結(jié)果：腦心通組腦組織Glu含量明顯降低（P﹤0.01，與模型組相比），并且大鼠腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1表達明顯減弱（P﹤0.01，與模型組相比）。結(jié)論：腦心通能夠減少腦缺血再灌注損傷后Glu的合成或釋放，抑制腦缺血再灌注損傷后NMDA-R的表達，防止Glu對NMDA-R的過度激活，從而起到防止興奮性氨基酸毒性作用，保護神經(jīng)細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：腦心通；缺血再灌注；谷氨酸

急性缺血性腦血管病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病之一，具有較高的致死率、致殘率。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注能引起一系列病理和生化的變化，主要表現(xiàn)為腦組織能量代謝障礙、興奮性氨基酸（EAA）釋放增加、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基產(chǎn)生、細(xì)胞腫脹和凋亡等[1，2]。本實驗用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察腦心通膠囊對大鼠腦組織中Glu含量及大鼠海馬組織NMDA-R1表達數(shù)量的變化，探討其治療急性缺血性腦血管病的部分作用機制，為臨床應(yīng)用中藥復(fù)方制劑提供實驗依據(jù)。

1實驗主要材料

選用四月齡無特定病原體（SPF）級SD大鼠50只，體重300±20g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心提供。步長腦心通膠囊； Glu試劑盒；NMDA-R1免疫組化試劑盒。

2實驗方法

2.1動物分組

選取大鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白組10只和假手術(shù)組10只，余30只造模。采用卒中指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)選取20只造模成功的大鼠，隨機分模型組10只、步長腦心通組10只。

2.2模型制備

采用由Nordtrom建立的2VO阻斷缺血模型，加鼠尾放血改良后用于本實驗?zāi)Ｐ椭苽鋄3]。要求術(shù)前禁食水。用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，仰臥固定，被皮，消毒，沿頸正中線皮膚切口，再用神經(jīng)剝離器分離與頸總動脈伴行的迷走神經(jīng)，完全暴露出雙側(cè)頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾閉頸總動脈，阻斷血流10min，然后恢復(fù)血流，間隔10min，共2次。阻斷的同時，剪鼠尾放血，以造成全腦低灌注，放血后熱凝止血，造成急性腦缺血再灌注損傷模型。

假手術(shù)組：麻醉及手術(shù)和實驗過程與造模組操作過程大致相同，但不阻斷頸總動脈亦不放血。

2.3評價造模成功的標(biāo)準(zhǔn)

采用卒中指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)[4]。卒中指數(shù)評分如下：毛發(fā)臟亂、顫抖各1分，運動減少或遲鈍1分，耳觸覺遲鈍為3分，眼固定狀睜開為3分，后肢外展呈八字為3分，上瞼下垂為1分，轉(zhuǎn)圈為3分，驚厥或爆發(fā)運動為3分，極度虛弱為6分?？偡?5分，﹥10分明顯有損傷。選取卒中指數(shù)﹥10分的動物為造模成功的動物。

2.4 Glu、NMDA-R1的檢測

采用比色法檢測腦組織中Glu的含量。采用免疫組織化學(xué)法檢測腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1免疫反應(yīng)細(xì)胞的表達。免疫組化SABC染色法，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。切片中免疫組化顯色的神經(jīng)細(xì)胞定量，采用顯微鏡計數(shù)法。

2.5統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，多組均數(shù)間均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3實驗結(jié)果

3.1腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠卒中指數(shù)評分的影響

表1顯示大鼠的卒中指數(shù)評分步長腦心通組比模型組低，且隨時間推移呈遞減趨勢。第1天，步長腦心通組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功，并且各用藥組動物選取無差異；第6天，步長腦心通組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義；第12天，步長腦心通組與模型組比較組比較有顯著性差異，說明步長腦心通都能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為癥狀和體征，有較好療效，說明中藥治療作用起效慢。

3.2腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Glu含量的影響

腦缺血再灌注后，與空白組、假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織Glu含量明顯升高，說明模型組發(fā)生了明顯的興奮性氨基酸毒性作用；與模型組比較，腦心通組較模型組Glu含量均下降，有顯著差異，說明腦心通可有效緩解腦缺血再灌注損傷后的EAA毒性作用。見表2。

3.3腦心通對腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織NMDA-R1表達數(shù)量的影響

腦缺血再灌注后，與空白組、假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1的表達數(shù)量均明顯低于空白組，說明腦組織內(nèi)NMDA-R1在腦缺血再灌注過程中被激活，導(dǎo)致受體門控通道開放，造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死；與模型組比較，步長腦心通組NMDA-R1的表達數(shù)量明顯高于模型組，說明步長腦心通可以抑制腦缺血再灌注損傷后NMDA-R的表達，保護及修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。見表3。

4討論

興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它們對缺血腦細(xì)胞具有興奮毒性作用，是缺血腦損害的重要環(huán)節(jié)。近年來，引起神經(jīng)元死亡的興奮性氨基酸毒性理論已成為神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要學(xué)說[5]。腦缺血再灌注損傷時，突觸前神經(jīng)末梢和星型膠質(zhì)細(xì)胞過量釋放Glu至細(xì)胞外，過度刺激Glu受體，特別是NMDA受體，引起神經(jīng)興奮性毒性作用，經(jīng)研究克隆出來的NMDA-R的亞型NMDA-R1是受體復(fù)合物的主要亞單位，具有NMDA-R的全部功能特點[6]。興奮性毒性作用不僅引起急性壞死，同時也啟動遲發(fā)型壞死，還與缺血后炎癥反應(yīng)有關(guān)[7]。此外，Glu還可通過抑制細(xì)胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。胱氨酸在體內(nèi)還原成半胱氨酸（CYS），CYS又是谷胱甘肽（GSH）的合成原料及限速因素，當(dāng)胞外Glu過多時可抑制谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體的功能，導(dǎo)致GSH合成減少，而GSH又是腦內(nèi)重要的活性氧清除劑，因此引起細(xì)胞內(nèi)氧自由基（如NO）堆積而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[8]；NMDA受體的激活與線粒體形成活性氧自由基有關(guān)；NMDA受體激活后可以破壞細(xì)胞內(nèi)外鉀離子的平衡從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，谷氨酸受體依賴型鈣通道和鈉通道同時向鉀離子開放，因而暴露于NMDA的神經(jīng)元因細(xì)胞內(nèi)鉀離子降低可最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其機制尚存爭議?？赡艿臋C制有：1）細(xì)胞內(nèi)鉀離子低于正常只可激活Caspase-3而誘導(dǎo)凋亡[9]。2）鉀離子外流長時程興奮性突觸后電位可激活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子依賴性蛋白，降解酶等，使神經(jīng)元脂膜、細(xì)胞骨架蛋白、核酸等重要結(jié)構(gòu)解體。總之，EAA造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用主要包括三個方面：一是參與腦內(nèi)多種代謝過程，使三羧酸循環(huán)受阻，ATP生成減少，加重對細(xì)胞的毒性作用；二是缺血再灌注后介導(dǎo)的大量Na+及H2O的內(nèi)流，造成細(xì)胞毒性腦水腫；三是通過激活NMDA-R，介導(dǎo)Ca2+大量內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，激發(fā)一系列瀑布樣病理生理過程，進一步導(dǎo)致神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。