液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯吡格雷酸的濃度及意義

譚憶

摘要：目的：探討利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行人血漿中氯吡格雷酸濃度測(cè)定的臨床意義。方法：對(duì)血漿樣品進(jìn)行測(cè)定，首先在樣品中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)美利曲辛，然后利用乙腈沉淀蛋白進(jìn)行提取。并與健康男性受試者口服硫酸氫氯吡格雷受試制劑的血藥濃度進(jìn)行生物等效性比較。結(jié)果：利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中氯吡格雷酸，其回收率為97.2%-103.9%。結(jié)論：利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)人血漿中的吡格雷酸的濃度進(jìn)行測(cè)定，具有較高的靈敏度，適用于臨床上氯吡格雷片的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞： 氯吡格雷；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；藥代動(dòng)力學(xué)

氯吡格雷是一種常用的抗血小板凝集及抗血栓藥物，其主要成分為噻吩并吡嗪類衍生物。這是一種經(jīng)過口服可在人體內(nèi)快速吸收的藥物，代謝速度較快，其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要是氯吡格雷酸[1]。氯吡格雷原型在人體內(nèi)的濃度非常低，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)者在口服硫酸氫氯吡格雷75 mg 后對(duì)體內(nèi)氯吡格雷酸的濃度進(jìn)行測(cè)定，其在人體內(nèi)地最大濃度（Cmax）僅為1010g[2]。國內(nèi)外關(guān)于氯吡格雷血藥濃度測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)較少，本文為了研究液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)人血漿中氯吡格雷酸的濃度測(cè)定的意義，具體研究如下：

1 儀器與試劑

本次試驗(yàn)選用的質(zhì)譜儀為Agilent6410 型三重四極桿質(zhì)譜儀，該類質(zhì)譜儀配套有電噴霧離子源，另外選用的色譜儀為Agilent1200 型高效液相色譜儀。后期數(shù)據(jù)分析選用的軟件為美國安捷倫公司生產(chǎn)的Agilent Mass Hunter Quatitative Analysis 。另外還有相關(guān)的分析天平（萬分之一、FA2204N）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Happy-TL16）以及MTN-2800W 型氮吹濃縮儀[3]。（試劑：硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品：USP LOT G1K326乙腈、醋酸銨：Dikma Technology（色譜純）；甲醇：天津市科密歐化學(xué)儀器試劑有限公司（色譜純）[4]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜/質(zhì)譜條件：色譜柱為（ 4. 6 mm × 100 mm，2. 7 μm、Dikma），流動(dòng)相為濃度0.4%甲酸。甲酸與乙腈的比例為30比70，色譜柱的溫度為30℃。進(jìn)樣量設(shè)定為50 μl，所采用的離子源為電噴離子源。干燥氣流速度設(shè)定為12. 0 L /min，溫度設(shè)定為350 ℃，霧化器壓力為55 psig； 四極桿溫度為100 ℃； 毛細(xì)管電壓為4. 0 KV。

2.2溶液配制

對(duì)照品溶液：精密稱取硫酸氫氯吡格雷13.54mg（換算成氯吡格雷為10.25mg），于100ml的量瓶中溶解，定容，搖勻，備用，甲醇最終制成濃度為102.5 μg/ml的氯吡格雷儲(chǔ)備液。先后精密移取一定量的氯吡格雷儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配制成一系不同濃度溶液，濃度先后為50. 4、151. 2、201. 6、1 008. 0、3 024. 0、4 032. 0、10 080. 0、30 240. 0、80 640. 0、1 00 800. 0 pg /ml。精密稱取地西泮對(duì)照品10. 04 mg（相當(dāng)與10.03mg的地西泮）置于100ml的量瓶中進(jìn)行溶解，定容，充分混勻，備用。此為內(nèi)標(biāo)溶液。最終濃度為100. 3 μg /ml 的地西泮，需要進(jìn)行低溫保存，保存溫度為4 ℃。精密移取1.0ml的地西泮內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于50ml的量瓶中，定容，搖勻，此次選取的溶解液為甲醇–水（ 1∶ 1） 溶液，充分混勻，此為地西泮內(nèi)標(biāo)溶液Ⅱ，濃度為2. 0 060 μg /ml。精密量取上述配比所得內(nèi)標(biāo)溶液Ⅱ2. 5 ml，置于100ml量瓶中，定容，搖勻，進(jìn)行第三次稀釋，所選取的稀釋液仍舊為甲醇–水（ 1∶ 1） 溶液，最終得到濃度50. 150 ng /ml 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3血漿樣品的處理

對(duì)于采取的血漿樣品需要進(jìn)行處理，首先需要量取空白血漿500μl，要進(jìn)行精密量取。將空白血漿進(jìn)行離心處理，血漿置于10ml的離心管，分別加入甲醇- 水（ 1∶ 1） 溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、50 mmol /L 醋酸銨溶液，劑量分別為50μl、50μl以及500μl。將以上混合液進(jìn)行渦旋混合，再加入3ml的甲基叔丁基醚，進(jìn)行充分震蕩，時(shí)間8min左右，然后在5℃下進(jìn)行離心，離心速度為1000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間6min。將有機(jī)層治愈離心管中，35℃水浴中進(jìn)行吹干，大約留取200 μl 流動(dòng)相溶液復(fù)溶，進(jìn)行渦旋混合，精密稱取50 μl 樣本分析[5]。

2.4專屬性試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)顯示氯吡格雷和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3. 7 和2. 7 min，說明血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯吡格雷的測(cè)定。進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯吡格雷酸，其回收率為97.2%-103.9%。

2.5提取回收率實(shí)驗(yàn)：需要精密量取氯吡格雷質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)溶液各50μl ，分別加入100μl流動(dòng)相，進(jìn)行充分混合，在混合均勻后提取50ul樣本作相應(yīng)研究，每個(gè)濃度有6份樣本，得到未經(jīng)提取的低、中、高3 個(gè)濃度的色譜峰面積（ 6 次測(cè)定的平均值） ，計(jì)算每一濃度提取后樣品（ 即精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)樣品） 與未經(jīng)提取樣品的色譜峰面積之比，得到的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的提取回收率見表1，本方法待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的回收率均達(dá)到50% 以上，RSD小于15%，待測(cè)物低、中、高三個(gè)濃度的回收率相接近，內(nèi)標(biāo)回收率穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

表1提取回收率

2.6血漿樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)：需要利用空白血漿制作血漿樣品，分別制作濃度為0.2以及15.0ng/ml的氯吡格雷血漿樣品，每個(gè)濃度的樣品需要有6份，6份樣品分別作不同的處理，第一份制成后立即處理分析；第二份需進(jìn)行24h的放置，然后進(jìn)行同等處理；第三份需要經(jīng)過冷凍處理，在超低溫（-20℃）下放置24h，后經(jīng)過室溫溶解，然后進(jìn)行同等處理；第四份凍融兩次后在進(jìn)行同等的處理，確定凍融的穩(wěn)定性；第5份冷凍30d后進(jìn)行處理，第六份冷凍60d后進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯吡格雷血漿樣品有很好的穩(wěn)定性，具體見表2

表二：血漿樣品穩(wěn)定性

3討論

本文主要探討利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行人血漿中氯吡格雷酸濃度測(cè)定的臨床意義。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以及乙醚提取處理法進(jìn)行氯吡格雷酸濃度測(cè)定具有較高的靈敏度，其靈敏度為10 pg /ml。本次試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，選取了新的提取溶劑--甲基叔丁基醚。這種溶劑可以在很大程度上減少實(shí)驗(yàn)中的基質(zhì)效應(yīng)[6]，促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)靈敏度的提升，是的靈敏度高達(dá)15pg /ml。本次試驗(yàn)所選取的測(cè)定方法可以有效的對(duì)硫酸氫氯吡格雷的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)或生物等效性評(píng)價(jià)。

在實(shí)驗(yàn)過程中，本文對(duì)多個(gè)流動(dòng)相的配比情況進(jìn)行了觀察與分析，分析中的乙腈比例會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生較大影響，會(huì)影響氯吡格雷的保留時(shí)間。乙腈的比例高低與氯吡格雷的保留時(shí)間成反比，當(dāng)乙腈濃度的降低，氯吡格雷的保留時(shí)間會(huì)延長[7]。試驗(yàn)中選取0. 4%甲酸–乙腈（ 40 ∶ 60） 作為流動(dòng)相進(jìn)行分析，在此條件下進(jìn)行觀察，氯吡格雷的保留時(shí)間較長，并且峰形較寬。實(shí)驗(yàn)如果選取0. 4% 甲酸- 乙腈（ 25 ∶ 75） 作為流動(dòng)相時(shí)，效果欠佳，因此流動(dòng)相的選擇最終確定為0. 4%甲酸水溶液-乙腈（ 30 ∶ 70） 不但使氯吡格雷和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)得到很好的分離，同時(shí)也縮短了分析時(shí)間，有利于生物樣品的分析。

綜上所述：利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)人血漿中的吡格雷酸的濃度進(jìn)行測(cè)定，具有較高的靈敏度，是臨床上適用的氯吡格雷片的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的方法。

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