復(fù)合菌劑與氮源對桉樹皮堆肥的理化性質(zhì)與微生物學(xué)特性的影響

陳金峰　黃麗麗　何慧中　劉可星　孫映波　趙超藝　朱根發(fā)

摘 要 為能更科學(xué)合理地利用桉樹皮生產(chǎn)植物育苗基質(zhì)，從物理化學(xué)和微生物學(xué)角度研究了添加活性微生物菌劑和氮源對桉樹皮堆肥過程的影響。結(jié)果表明：化學(xué)處理（氮源）和生物-化學(xué)聯(lián)合處理（氮源+菌劑）的pH先下降后上升，EC持續(xù)下降；氨氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低，而硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在試驗(yàn)期間總體上一直處于增加趨勢；全磷和全鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)到試驗(yàn)結(jié)束時均有所增加；纖維素和木質(zhì)素降解迅速；細(xì)菌數(shù)量在最高溫出現(xiàn)之后迅速增殖，真菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。生物處理（菌劑）對桉樹皮堆肥作用有限。在化學(xué)處理基礎(chǔ)上添加菌劑，降低了堆肥材料的電導(dǎo)率和硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；促進(jìn)了全鉀的積累；對桉樹皮纖維素和木質(zhì)素的降解無明顯作用；促進(jìn)了可培養(yǎng)細(xì)菌的增殖，但對可培養(yǎng)真菌有拮抗作用。

關(guān)鍵詞 桉樹皮；物理化學(xué)性質(zhì)；纖維素；木質(zhì)素；細(xì)菌；真菌

中圖分類號 S792.39 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

隨著以泥炭、珍珠巖、蛭石為原材料的傳統(tǒng)型輕型基質(zhì)資源的日益枯竭，迫切需求可再生的替代原料。農(nóng)林生物質(zhì)是一種物美價廉的可再生資源，應(yīng)用農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)輕型基質(zhì)已成為目前科學(xué)研究的前沿，農(nóng)林廢棄物開發(fā)利用的比例和應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。堆肥是可持續(xù)利用農(nóng)林廢棄物的重要方法，但目前研究相對較多的主要有稻殼、花生殼、蔗渣、椰糠、麥秸稈和玉米秸等，對桉樹皮堆肥的研究仍不多。

中國是桉樹（Eucalyptus spp.）種植大國，每年都會產(chǎn)出大量桉樹皮。據(jù)中國林學(xué)會桉樹專業(yè)委員會統(tǒng)計(jì)，截至2013年8月中國桉樹人工林的面積已達(dá)450萬hm2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了桉樹原產(chǎn)國澳大利亞（926 hm2）[1]。中國桉樹年采伐量約為10%，即年采伐量45萬hm2，每公頃產(chǎn)木材100～120 t，桉樹皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～15%[2]，若按此估算，中國每年可產(chǎn)生桉樹皮540～810萬t。目前中國桉樹主要用來造紙、制纖維板、木片、膠合板和提煉桉樹油等[3]，期間產(chǎn)生的大量桉樹皮大多被隨地丟棄、任其腐爛，甚至放火燒掉，桉樹皮資源被大量浪費(fèi)，不但污染了環(huán)境，還與目前的清潔生產(chǎn)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的要求背道而馳。

利用桉樹皮堆肥生產(chǎn)植物育苗基質(zhì)是合理利用桉樹資源、解決桉樹皮隨意丟棄所造成環(huán)境污染的重要措施之一。近年來已有關(guān)于利用桉樹皮生產(chǎn)育苗基質(zhì)進(jìn)行育苗的報(bào)道，張沛健等[4]對桉樹皮堆漚過程中容重、孔隙度、電導(dǎo)率、陽離子交換量等物理化學(xué)性質(zhì)的研究；Hardy和Sivasithamparam[5]對桉樹皮堆漚過程中微生物、物理化學(xué)性質(zhì)變化規(guī)律的研究。盡管如此，因不同研究采用的方法和目的不同，對于桉樹皮堆肥過程的研究仍需要進(jìn)一步加強(qiáng)。本文研究了生物處理（生物活性菌劑）、化學(xué)處理（氮源）和生物-化學(xué)聯(lián)合處理（生物活性菌劑+氮源）對桉樹皮堆肥過程中氮磷鉀營養(yǎng)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、木質(zhì)素、纖維素降解和微生物群落數(shù)量的影響，旨在進(jìn)一步為桉樹皮資源的科學(xué)合理應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用桉樹皮來自惠州市橫瀝鎮(zhèn)，pH7.27，電導(dǎo)率（EC）為820 μs/cm，全碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.84%，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.43%，氨氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.24 mg/kg，硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為244.51 mg/kg，全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51%，全鉀為0.41%。桉樹皮碳氮比為104.28。試驗(yàn)中所用氮源為碳銨，添加菌劑為人工配制復(fù)合菌劑。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合菌劑配制 所有菌種均來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新肥料資源研究中心。其中綠色木霉菌（Trichoderma viride）、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、啤酒酵母（Saccharomyces revisiae）、假絲酵母（Candida tropicalis）、解朊假絲酵母（Candida famata）用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus magaterium）、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；5406菌種用高氏1號液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。挑取菌落，將各個菌種分別放入150 mL三角瓶中，加入50 mL液體培養(yǎng)基，在150 r/min，28 ℃條件下發(fā)酵72 h，制成單一菌劑，發(fā)酵完成時各菌體含量高于1×108 cfu/mL，然后等體積混入三角瓶中，制成復(fù)合菌劑。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)堆體大小為1 m3，共設(shè)3個處理，分別為：生物處理，即單純接種菌劑處理（T1）、化學(xué)處理，即單純添加氮源處理（T2）和生物-化學(xué)聯(lián)合處理，即菌劑與氮源聯(lián)合處理（T3），以桉樹皮原樣為對照（CK），每處理1個堆體。其中T1和T3處理的菌劑接種量為0.1%（質(zhì)量比）。T2和T3處理加入1.8 kg碳銨，使T2和T3處理的碳氮比為30左右，加水使各處理水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在60%左右，試驗(yàn)開始后根據(jù)堆體溫度情況分別在第8、15、22、28 d翻堆。

1.2.3 分析方法 堆肥共持續(xù)30 d，每天15 ： 00左右，從堆體上部插入溫度計(jì)至堆體內(nèi)部中心，記錄堆體溫度。分別在第8、15、22、28天，在堆體中心下部20 cm處，四點(diǎn)采樣法取樣，充分混勻帶回實(shí)驗(yàn)室，平均分成3份，分別測定理化指標(biāo)。其中pH采用pH計(jì)測定，電導(dǎo)率（EC）采用電導(dǎo)率儀測定，物料 ∶ 水體積比為1 ∶ 6；銨態(tài)氮采用靛酚藍(lán)比色法；硝態(tài)氮用KCl浸提，后在220 nm和275 nm處進(jìn)行比色分析；全磷和全鉀參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525-2012《有機(jī)肥料》[6]，采用全氮磷鉀硫酸-過氧化氫消煮法測定；纖維素和木質(zhì)素采用前人方法測定[7]；細(xì)菌和真菌數(shù)量用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 19.0（IBM Corporation，Armonk，NY，United States）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用p=0.05水平表征處理間差異的顯著與否。以O(shè)rigin 8.5（OriginLab Corporation，Northampton，MA，United States）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹皮堆肥過程中溫度變化

桉樹皮堆肥過程中各個處理的溫度變化見圖1。由圖1可以看出，在堆漚的前8 d，T2和T3的溫度不斷上升，至第8天時分別達(dá)到最大值55.2 ℃和54.3 ℃。翻堆后溫度有所下降，以后歷次翻堆2處理的溫度均有微略上升，然后再次下降。在最高溫之后，T2和T3處理的溫度一直處在32.9～51.7 ℃和32.5～50.7 ℃之間。T1處理溫度與對照相比無明顯變化。

2.2 桉樹皮堆肥過程中pH和EC變化

桉樹皮堆肥過程中pH和EC變化見圖2。從圖2可以看出，由于碳銨水溶液具有較強(qiáng)的堿性，T2和T3處理在加入碳銨后第8天的pH（8.94）仍顯著高于對照（p<0.05）。其后T2和T3處理的pH開始不斷下降，到第22天時已經(jīng)顯著低于對照處理（p<0.05），至堆肥結(jié)束時，T2和T3處理的pH略有所上升（7.03）。T1處理的pH始終在7.5上下浮動，相對對照無大的變化。單純添加菌劑并不會引起堆體pH的變化，添加碳銨則會引起堆體pH大幅度變動，隨著堆體內(nèi)微生物活動，T2和T3處理的pH在堆漚前后也發(fā)生了大幅度變化。

在第8天T2和T3處理的EC均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照，隨后T2和T3處理的EC值不斷下降。T3處理的EC值始終低于T2處理，從第15天開始兩處理之間EC出現(xiàn)顯著性差異（p<0.05）。T1處理的EC自始至終無明顯變化。

2.3 桉樹皮堆肥過程中氮磷鉀營養(yǎng)元素變化

桉樹皮堆肥過程中氮磷鉀營養(yǎng)元素變化見圖3。由圖3可以看出，從第8～13天，T2和T3處理的氨氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)上升的趨勢，在此之后逐漸降低到210 mg/kg左右，T2和T3之間無顯著性差異（p>0.05）。T1處理因未添加碳銨，其氨氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在試驗(yàn)期間變化不大。與此同時，T2和T3處理的硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也整體上呈現(xiàn)增加的趨勢，到試驗(yàn)結(jié)束時T2和T3處理的硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于第8天，T2和T3處理間也產(chǎn)生了顯著差異，T3處理的硝態(tài)氮水平顯著低于T2處理（p<0.05）。

T1、T2和T3處理的全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨堆漚時間持續(xù)增加，到試驗(yàn)結(jié)束時總磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.64%、0.64%和0.63%，3種處理的全磷均高于對照（0.59%），但未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明這3種處理對總磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不大。

T2和T3處理全鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，至第30天時分別達(dá)到了0.51%和0.54%。T3處理全鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終都高于T2處理，到試驗(yàn)結(jié)束時T3處理全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)已顯著大于T2處理（p<0.05），說明在有充足氮源條件下，接種功能微生物促進(jìn)了基質(zhì)中鉀元素的積累。

2.4 桉樹皮堆肥過程中纖維素和木質(zhì)素變化

桉樹皮堆肥過程中纖維素和木質(zhì)素變化見圖4。由圖4可以看出，桉樹皮原樣中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.4%，在堆肥進(jìn)行至第8天時，各個處理的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)尚未發(fā)生明顯變化，但自此之后T2和T3處理的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，至試驗(yàn)結(jié)束時已分別下降到18.4%和18.3%，相比對照分別減少了55.6%和55.8%，T2和T3處理、T1和對照之間在整個堆肥過程中均未表現(xiàn)出顯著性差異（p>0.05），說明接種處理并未對桉樹皮的纖維素降解產(chǎn)生效果，氮素缺乏限制了桉樹皮纖維素的降解。

同纖維素的降解規(guī)律一樣，在第8天時木質(zhì)素尚未發(fā)生明顯的降解。之后，T2和T3處理的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，分別從第8天的33.6%和33.2%降低至第30天的18.4%和18.8%，相比對照分別降低了45.9%和44.7%，T2和T3處理、T1和對照之間在整個堆肥過程中無顯著性差異（p>0.05），同樣說明接種的微生物未對桉樹皮的木質(zhì)素降解產(chǎn)生效果。

2.5 桉樹皮堆肥過程中微生物群落變化

桉樹皮堆肥過程中微生物群落變化見圖5。由圖5可以看出，在堆肥第8天時T2和T3處理的細(xì)菌數(shù)量顯著低于對照（p<0.05），但是自此之后細(xì)菌的數(shù)量呈指數(shù)增加。到第22天時T2處理的細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大值1.14×1010 cfu/g，到第30天試驗(yàn)結(jié)束時，略微下降；T3處理的細(xì)菌數(shù)量一直不斷增加，在第30天達(dá)到最大值（1.26×1010 cfu/g），此時T3處理細(xì)菌數(shù)量顯著大于T2處理（p<0.05）。T1處理的細(xì)菌數(shù)量除在第8天時比對照低以外，在其它時間內(nèi)均大于對照處理，表明外接細(xì)菌在T1處理中還是有所增殖。

T1、T2和T3處理的真菌數(shù)量在第8天時就顯著高于對照（p<0.05），此后這3個處理的真菌數(shù)量均呈現(xiàn)出了先增加后減少的趨勢，盡管T2、T3處理與T1處理真菌的數(shù)量不在一個數(shù)量級上。T2和T3處理的真菌數(shù)量最大值均出現(xiàn)在第22天，分別為1.31×1011和1.37×1011 cfu/g。T2和T3處理的真菌數(shù)量在最大值出現(xiàn)之前無顯著差異（p>0.05），但在堆肥結(jié)束時T3處理的真菌數(shù)量出現(xiàn)了顯著低于T2處理的情況（p<0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

溫度是堆肥過程中的重要物理指標(biāo)，溫度的高低反映微生物代謝的強(qiáng)弱，同時也對微生物種群起著選擇作用[8]。在堆肥初期，微生物活動旺盛，產(chǎn)生大量的熱量殺死病原微生物、蟲卵和雜草種子等，同時也使得堆肥基質(zhì)中的微生物群落由嗜熱菌到嗜溫菌轉(zhuǎn)變。堆肥過程中，要使微生物達(dá)到最高的降解效率和維持最大的生物多樣性，堆體溫度最好處于30～45 ℃之間[10]。本試驗(yàn)中，T2和T3處理的溫度大部分時間都處在這個溫度范圍內(nèi)。

有機(jī)物料通常能在較寬的pH值（3～11）范圍內(nèi)進(jìn)行堆肥，最佳范圍在5.5～8.0[9]，盡管在處理前期T2和T3堆體的pH高于最適范圍，但在中后期均在最適范圍之內(nèi)。T2、T3的pH先降后升，張沛健等[4]和Liu等[11]在分別堆漚桉樹皮、牛糞-稻殼混合物時，均發(fā)現(xiàn)了相似的pH變化現(xiàn)象，這可能是由于在堆漚前期微生物分解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生大量小分子有機(jī)酸的緣故。

EC值反映堆肥物料中可溶性鹽的含量。T2、T3處理的EC值在整個堆肥過程中不斷降低，這可能是由堿性條件下氨氣揮發(fā)，微生物對無機(jī)氮素的同化作用及人為的加水稀釋作用共同造成的。單純添加菌劑不會引起堆體EC的變化，在有氮源補(bǔ)充的條件下添加菌劑降低了EC值，這可能跟T3處理的微生物消耗了更多的可溶性鹽有關(guān)。

T2和T3處理氨氮和硝態(tài)氮彼此消漲的現(xiàn)象與Liu等[10]在堆漚牛糞和稻殼混合物時所發(fā)現(xiàn)規(guī)律一致。在有機(jī)質(zhì)堆肥的初期階段，微生物首先分解利用易降解的蛋白質(zhì)和糖等產(chǎn)生游離銨，造成堆體中氨氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，隨后氨氮被硝化細(xì)菌有氧代謝成硝酸鹽，進(jìn)而導(dǎo)致氨氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降，硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。在有機(jī)質(zhì)堆肥過程中，微生物代謝活動產(chǎn)生大量的CO2釋放到大氣中，碳流失會導(dǎo)致堆體中磷素的濃縮效應(yīng)，使得基質(zhì)中全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[11]。T2和T3全鉀含量的提高也是由于碳流失的濃縮效應(yīng)造成。

纖維素的降解一般由真菌完成，也有細(xì)菌和放線菌，木質(zhì)素的降解則主要由真菌完成[12]。在堆肥初期細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物尚處在增殖初期，主要利用堆體中易被利用的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類物質(zhì)，尚未大規(guī)模利用纖維素和木質(zhì)素作為碳源，從而造成在此階段纖維素和木質(zhì)素降解速率緩慢，但是隨著微生物的大量繁殖、堆體溫度的升高和易被利用物質(zhì)的消耗，微生物開始轉(zhuǎn)向氧化分解纖維素和木質(zhì)素等較難降解的物質(zhì)，造成纖維素和木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降。但添加菌劑并未對桉樹皮纖維素和木質(zhì)素的降解產(chǎn)生明顯影響，說明纖維素和木質(zhì)素的降解由桉樹皮攜帶的微生物完成。另外，纖維素一般較易被微生物降解，木質(zhì)素則較難，本試驗(yàn)中木質(zhì)素降解程度低于纖維素說明了此問題。

碳氮比是影響真菌生長的一個重要因素，盡管某些真菌需要在較低氮源條件下生長，降解木質(zhì)素，但是絕大多數(shù)真菌還是需要適宜的氮素水平[13]，低氮素水平往往不利于真菌對木質(zhì)素的降解。T1處理盡管添加了菌劑，但是木質(zhì)素降解效率低下，這是缺少氮源的緣故。在桉樹皮堆肥中，添加適量氮源是促進(jìn)桉樹皮木質(zhì)素降解的首要選擇。

在有機(jī)物料堆肥初期，細(xì)菌和真菌可利用有機(jī)物料中易降解的有機(jī)質(zhì)大量繁殖，數(shù)量迅速增加，同時堆體溫度也不斷升高[12]。本試驗(yàn)中最高溫度出現(xiàn)在第8天，而此時細(xì)菌、真菌的數(shù)量均很低，此后才呈現(xiàn)迅速增長的趨勢，這是由于在升溫過程中，大多數(shù)嗜溫菌死亡，僅剩下少數(shù)能耐受高溫的嗜熱菌造成的，隨著堆體溫度的降低嗜溫菌重新繁殖，致使其種群不斷擴(kuò)大[14]。

大部分真菌屬于嗜溫真菌，其最適生長溫度在25～30 ℃之間[15]，高溫條件不利于真菌的生長，因此在堆肥的第8天真菌的數(shù)量較少。在第22天時堆體溫度仍然在真菌適宜生長的溫度范圍內(nèi)，但由此開始T2和T3處理的真菌數(shù)量出現(xiàn)了下降。這種下降不可能是由溫度因素引起，在堆肥處理中微生物自身代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也會對其生長產(chǎn)生影響，例如真菌分解木質(zhì)纖維產(chǎn)生的葡萄糖過剩也會抑制真菌纖維素酶的活性[16]。本試驗(yàn)中T2和T3處理的真菌降解纖維素和木質(zhì)素旺盛，其終產(chǎn)物葡萄糖的過量積累有可能也影響到了真菌的生長。另外，不同微生物類群間的拮抗作用也會導(dǎo)致微生物種群的此消彼長。在試驗(yàn)后期T3處理的真菌數(shù)量顯著低于T2處理（p<0.05），這可能與T3處理細(xì)菌群落大量繁殖有關(guān)，在底物有限的情況下真菌的繁殖受到了一定程度的抑制[12]。

3.2 結(jié)論

（1）單純添加菌劑處理，對桉樹皮堆體的理化性質(zhì)和微生物特性影響不大，添加充足的氮源是桉樹皮堆肥的必要手段。

（2）在有充足氮源的情況下，添加活性菌劑能夠降低堆肥材料的電導(dǎo)率，促進(jìn)全鉀積累，細(xì)菌增殖，但會降低硝態(tài)氮的形成，抑制真菌的繁殖。

（3）盡管添加菌劑在堆肥后期影響了真菌的繁殖使真菌的數(shù)量顯著下降，但并未對桉樹皮纖維素和木質(zhì)素的降解效率產(chǎn)生影響。

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