琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析

劉志發(fā) 潘騰飛 潘東明

摘 要 利用RT-PCR技術(shù)從‘琯溪蜜柚中克隆得到1條PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列，命名為CmPME1。該序列編碼一個(gè)含有582個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量63.37 ku，該蛋白屬于穩(wěn)定的堿性親水性蛋白。同源性分析表明：其編碼的氨基酸序列與可可樹(shù)（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）的同源性分別為76%、74%，與甜橙的氨基酸序列同源性高達(dá)99%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，隨著果實(shí)的發(fā)育，CmPME1的表達(dá)量逐漸升高，在花后170 d達(dá)到最高，然后逐漸降低，遠(yuǎn)中柱汁胞CmPME1的表達(dá)量高于近中柱。

關(guān)鍵詞 琯溪蜜柚；PME；克??；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào) S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

琯溪蜜柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.]果實(shí)存在汁胞?；纳聿『Γ?表現(xiàn)為汁胞中柱和軸端汁胞異常膨大， 汁胞變硬、細(xì)胞壁加厚、木質(zhì)纖維化、出汁率下降， 風(fēng)味變淡。琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；ǔ哪野杲俣酥l(fā)生， 后漸向果心發(fā)展， 其中以果心處長(zhǎng)形汁胞?；顬閲?yán)重[1-3]。據(jù)觀(guān)察，琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；l(fā)生在果實(shí)生長(zhǎng)后期（一般為9月中下旬開(kāi)始），采后貯藏期間果實(shí)汁胞?；M(jìn)一步加重[2]。有報(bào)道指出果膠甲酯酶與柑橘果實(shí)的?；嘘P(guān)[4-5]。

果膠甲酯酶（pectinmethylesterase，簡(jiǎn)稱(chēng)PME、PE， EC： 3. 1. 1. 11）廣泛存在于植物以及一些細(xì)胞壁降解的微生物中[6]。果膠甲酯酶能水解果膠生成果膠酸、甲醇、氫離子，進(jìn)而導(dǎo)致果膠酸鈣的形成[7-9]。PME屬于多基因家族，由于PME結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的多樣性，其作用也存在差異[10-11]。植物中果膠甲酯酶在細(xì)胞壁降解[12-13]，小孢子發(fā)生和花粉管發(fā)育[14-16]，種子萌發(fā)[17]，根尖延伸[18]，果實(shí)的軟化成熟[19]等方面起著重要作用。近幾年來(lái)，在植物中有關(guān)PME基因的克隆與表達(dá)已有許多報(bào)道，已從草莓、煙草、白菜等植物中克隆得到果膠甲酯酶基因[20-22]，認(rèn)為該基因與果實(shí)衰老過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化、植物病毒之間存在相互作用、雄性不育等功能有關(guān)。此外，在柑橘汁胞和柑橘皮中也克隆得到了PME基因[23-24]。

為從探明‘琯溪蜜柚CmPME1在果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)水平變化與果實(shí)?；年P(guān)系，本研究利用RT-PCR技術(shù)從‘琯溪蜜柚汁胞中克隆得到CmPME1的ORF序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同部位的CmPME1的表達(dá)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料采自漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)果園。采集時(shí)間為2013年7月16日至10月28日，約每隔10 d采集1次樣品。取汁胞凍于液氮中，存放于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取、檢測(cè)及cDNA第一鏈的合成

柚汁胞總RNA提取參照鐘鳳林等[25]的Trizol方法提取，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。按照Trans ScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA第一條鏈。

1.2.2 CmPME1基因ORF的克隆 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)甜橙基因組中PME中的cDNA序列，在起始密碼子和終止密碼子位置設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），引物合成與測(cè)序均委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。

以琯溪蜜柚汁胞cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板cDNA1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.15 μL，加水至終體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測(cè)，將目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序。

1.2.3 CmPME1的熒光定量表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成：以‘琯溪蜜柚Tubulin基因?yàn)閮?nèi)參基因，根據(jù)已克隆的CmPME1基因的ORF序列，按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物原則設(shè)計(jì)引物（表2）。

用試劑盒的方法分別提取‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同部位汁胞的總RNA，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物重復(fù)，并以它們?yōu)槟０?，按照PrimeScript RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR在羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行。將合成的cDNA（500 ng/μL）稀釋10倍作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR PremixEx TaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至終體積20 μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。PCR反應(yīng)程序采用兩步法：95 ℃ 30 s（預(yù)變性過(guò)程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)（PCR反應(yīng)過(guò)程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（熔解曲線(xiàn)分析過(guò)程）。根據(jù)熒光定量PCR目的基因CmPME1和內(nèi)參基因β-Tubulin的Ct值，利用2-ΔΔCT（Livak）方法對(duì)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同部位汁胞的CmPME1基因進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.2.4 序列分析與生物信息學(xué)分析 采用ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析；采用Tmpered（http：//www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析；采用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與分析；利用Mega 5.22進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmPME1 ORF序列的獲得與CmPME1系統(tǒng)進(jìn)化分析

CmPME1所擴(kuò)增的ORF片段大小為1 748 bp（圖1），經(jīng)DNAMAN軟件分析CmPME1編碼582個(gè)氨基酸，ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子（圖2）。經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與陸地棉（Gossypium hirsutum）、可可樹(shù)（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的氨基酸序列的同源性分別達(dá)77%、76%、74%和71%，與甜橙（Citrus sinensis）的氨基酸序列同源性為99%。利用Mega 5.22近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)CmPME1與來(lái)自12種不同物種的PME蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖3）。從圖3可以看出，12種不同植物的PME蛋白聚成一類(lèi)，CmPME1和同屬于柑橘屬的甜橙的PME蛋白親緣關(guān)系最近。

2.2 CmPME1編碼蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

通過(guò)ProtParam軟件對(duì)CmPME1蛋白進(jìn)行基本的理化分析可知，相對(duì)分子量為63.37 ku，分子式為C2 784H4 428N796O851S22。該蛋白由20種氨基酸殘基組成，其中丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）的含量較豐富，比例分別為9.8%、8.2%、7.9%；該蛋白含54個(gè)帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）和66個(gè)帶正電的氨基酸（Arg+Lys）， 總平均疏水指數(shù)-0.251，其理論等電點(diǎn)為9.16，不穩(wěn)定指數(shù)為29.74，說(shuō)明該蛋白屬于穩(wěn)定的堿性親水性蛋白。

利用程序wolf psort分別對(duì)‘琯溪蜜柚CmPME1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，CmPME1蛋白在線(xiàn)粒體內(nèi)膜的分值最高，推測(cè)該蛋白定位在線(xiàn)粒體內(nèi)膜。

2.3 CmPME1在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同部位的表達(dá)

CmPME1在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同部位的熒光定量表達(dá)如圖4。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的增加，CmPME1的表達(dá)量呈現(xiàn)先逐漸升高后逐漸降低趨勢(shì)，在花后170 d表達(dá)量達(dá)到最高，遠(yuǎn)中柱汁胞CmPME1的表達(dá)量高于近中柱。

3 討論與結(jié)論

目前，PME已經(jīng)在很多植物中被克隆和研究，但在柚中未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆得到1條PME的ORF序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，CmPME1與其它植物的PME有較高的同源性。CmPME1氨基酸序列與甜橙親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)99%。

大部分種類(lèi)的果實(shí)中PME活性都隨果實(shí)的成熟程度增強(qiáng)，使果膠、纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)發(fā)生降解，從而導(dǎo)致果肉的軟化[26-27]。熒光定量PCR結(jié)果表明，‘琯溪蜜柚果實(shí)的成熟過(guò)程中，CmPME1的表達(dá)量逐漸升高?？赡芘c果實(shí)成熟過(guò)程中，果實(shí)變軟有關(guān)?！g溪蜜柚果實(shí)汁胞?；l(fā)生在果實(shí)生長(zhǎng)后期，本研究CmPME1在花后170 d表達(dá)量最高，遠(yuǎn)中柱汁胞CmPME1的表達(dá)量高于近中柱?？赡苁怯捎阼止麑?shí)汁胞在花后170 d左右開(kāi)始發(fā)生?；；^(guò)程中CmPME1基因的表達(dá)量逐漸降低。Singh等[28]報(bào)道，粒化與果膠甲酯酶的活性呈負(fù)相關(guān)，粒化程度高的Kaula寬皮柑橘的果膠甲脂酶活性最低。而‘琯溪蜜柚果實(shí)汁胞粒化通常從囊瓣近蒂端汁胞發(fā)生，后漸向果心發(fā)展。Chakrawar等[29]也報(bào)道?；麑?shí)的果膠甲酯酶活性比正常的低，并認(rèn)為果膠甲酯酶與?；嘘P(guān)?？梢?jiàn)，近中柱CmPME1的表達(dá)量較遠(yuǎn)中柱低，可能是因?yàn)榻兄钜装l(fā)生?；?，表達(dá)量較低。佘文琴等[30]研究了‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育過(guò)程中PME酶活性，發(fā)現(xiàn)其活性在9月28日達(dá)到最高，之后下降，這與CmPME1的表達(dá)量的變化趨勢(shì)有一定相似性。但是否因粒化導(dǎo)致CmPME1的表達(dá)量下降還待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Daulta B S， Arora R K. Studies on granulation in different cultivars of sweet orange（C. sinensis Osbeck）[J]. Haryana Journal of Horticultural Sciences， 1990， 19（1-2）： 18-21.

[2] 潘東明， 鄭國(guó)華， 陳桂信， 等. 琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 1999， 16（3）： 202-209.

[3] 張振玨， 謝志南， 許文寶. 琯溪蜜柚汁囊分化和粒化過(guò)程的解剖學(xué)觀(guān)察[J]. 植物學(xué)報(bào)， 1999， 41（6）： 16-19.

[4] Chakrawar V R， Singh R J. Studies on citrus granulation II Physiological and biochemical aspects of granulation[J]. Haryana J Hort Sci， 1977， 6（3/4）： 132-135.

[5] Prasanna V， Prabha T N， Tharanathan R N. Fruit ripening phenomena-an overview[J]. Critical reviews in food science and nutrition， 2007， 47（1）： 1-19.

[6] Ly-Nguyen B， Van Loey A M， Fachin D， et al. Partial purification， characterization， and thermal and high-pressure inactivation of pectin methylesterase from carrots（Daucus carrota L.）[J]. Journal of agricultural and food chemistry， 2002， 50（19）： 5 437-5 444.

[7] Alonso J， Rodriguez T， Canet W. Effect of calcium pretreatments on the texture of frozen cherries. Role of pectinesterase in the changes in the pectic materials[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1995， 43（4）： 1 011-1 016.

[8] Alonso J， Canet W， Rodriguez T. Thermal and calcium pretreatment affects texture， pectinesterase and pectic substances of frozen sweet cherries[J]. Journal of food science， 1997， 62（3）： 511-515.

[9] Willats W G T， McCartney L， Mackie W， et al. Pectin： cell biology and prospects for functional analysis[J]. Plant Mol Biol， 2001 ， 47（1-2）： 9-27.

[10] Markovic O， Janecek S. Pectin degrading glycoside hydrolases of family 28： sequence-structural features， specificities and evolution[J]. Protein Engineering， 2001， 14（9）： 615-631.

[11] Pelloux J， Rusterucci C， Mellerowicz E J. New insights into pectin methylesterase structure and function[J]. Trends in plant science， 2007， 12（6）： 267-277.

[12] Al-Qsous S， Carpentier E， Klein-Eude D， et al. Identification and isolation of a pectin methylesterase isoform that could be involved in flax cell wall stiffening[J]. Planta， 2004， 219（2）： 369-378.

[13] Micheli F. Pectin methylesterases： cell wall enzymes with important roles in plant physiology[J]. Trends in plant science， 2001， 6（90）： 414-419.

[14] Rogers H J， Bate N， Combe J， et al. Functional analysis of cis-regulatory elements within the promoter of the tobacco late pollen gene g10[J]. Plant molecular biology， 2001， 45（5）： 577-585.

[15] Tian G W， Chen M H， Zaltsman A， et al. Pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth[J]. Developmental biology， 2006， 294（1）： 83-91.

[16] Bosch M， Cheung A Y， Hepler P K. Pectin methylesterase， a regulator of pollen tube growth[J]. Plant Physiology， 2005， 138（3）： 1 334-1 346.

[17] Ren C， Kermode A R. An increase in pectin methyl esterase activity accompanies dormancy breakage and germination of yellow cedar seeds[J]. Plant Physiology， 2000， 124（1）： 231-242.

[18] Pilling J， Willmitzer L， Bücking H， et al. Inhibition of a ubiquitously expressed pectin methyl esterase in Solanum tuberosum L. affects plant growth， leaf growth polarity， and ion partitioning[J]. Planta， 2004， 219（1）： 32-40.

[19] Singh R， Sing R J. Pectinesterase activity in relation to granulation in citrus fruits[J]. Sci Cult， 1985（51）： 315-316.

[20] Castillejo C， de la Fuente J I， Iannetta P， et al. Pectinesterase gene family in strawberry fruit： study of FaPE1， a ripening‐specific isoform[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（398）： 909-918.

[21] 李春波， 高 鋒， 鐘永旺， 等. 煙草果膠甲基酯酶（PME）基因的克隆及功能分析[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2004， 31（7）： 643-649.

[22] 劉志勇， 李承彧， 葉雪凌， 等. 大白菜果膠甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（2）： 325-334.

[23] Joseph Nairn C， Lewandowski D J， Burns J K. Genetics and expression of two pectinesterase genes in Valencia orange[J]. Physiologia Plantarum， 1998， 102（2）： 226-235.

[24] 葉 華， 馬 力. RT-PCR法克隆柑橘皮果膠酯酶基因[J]. 包裝與食品機(jī)械， 2011， 29（3）： 6-8.

[25] 鐘鳳林， 郭志雄， 馬傳營(yíng)， 等. 琯溪蜜柚汁胞RNA提取方法的比較[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2010（2）： 109-112.

[26] Brummell D A， Da lcin v， Carlos H Crisosto， et al. Cell wall metabolism during maturation， ripening senescence of peach fruit[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（405）： 2 029-2 099.

[27] Giovannoni J. Molecular biology of fruit maturation and ripening[J]. Annual review of plant biology， 2001， 52（1）： 725-749.

[28] Singh R， Sing R J. Pectinesterase activity in relation to granulation in citrus fruits[J]. Sci Cult， 1985（51）： 315-316.

[29] Chakrawar V R， Singh R J. Studies on citrus granulation II physiological and biochemical aspects of granulation[J]. Haryana J Hort Sci， 1977， 6（3-4）： 132-135.

[30] 佘文琴， 趙曉玲， 潘東明， 等. 細(xì)胞壁代謝與琯溪蜜柚果實(shí)成熟過(guò)程汁胞粒化的關(guān)系[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2008， 16（6）： 545-550.