高寒地區(qū)蛹蟲草搖瓶液體培養(yǎng)基優(yōu)化

孫慧娟

摘要 [目的]篩選出高寒地區(qū)蛹蟲草搖瓶液體培養(yǎng)基的最佳配方。[方法]以菌絲體干質(zhì)量濃度為指標(biāo)，首先采用單因素試驗(yàn)方法篩選出液體培養(yǎng)基中的最優(yōu)碳源和氮源，然后運(yùn)用方差分析得出最佳碳氮肥比（C/N）。[結(jié)果]遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，碳氮肥比為2∶1和1∶1時(shí)均可使菌絲達(dá)到較大的生物量。[結(jié)論]該研究為高寒地區(qū)蛹蟲草的液體發(fā)酵培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 高寒地區(qū)；蛹蟲草；液體培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S567；Q949.327.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）34-152-02

蛹蟲草[Cordyceps militaris（ L.） Link]又名北蟲草、北冬蟲夏草等，隸屬于菌物界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、蟲草菌科（Cordycipitaceae）。到目前為止，在全世界范圍有近400種的蟲草屬真菌被報(bào)道，其中常見的被人們所熟知的有冬蟲夏草、蟬花、蛹蟲草、霍克斯蟲草等，其中以冬蟲夏草和蛹蟲草最為重要。由于冬蟲夏草目前尚不能人工栽培且野生資源逐年下降，不能滿足市場(chǎng)需求資源十分稀缺。而人工栽培的蛹蟲草與野生的冬蟲夏草主要的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分十分相近，甚至有的高于冬蟲夏草，所以蛹蟲草的商品化生產(chǎn)應(yīng)運(yùn)而生。研究表明，采用液體培養(yǎng)的蟲草菌絲體，其所含的主要成分與天然子實(shí)體十分接近[1]，且具有培養(yǎng)條件易控制、產(chǎn)量高、生長(zhǎng)周期短且活性物質(zhì)易于提取等特點(diǎn)，有望成為野生蟲草的替代品[2-4]。因此，該試驗(yàn)對(duì)蛹蟲草在高寒地區(qū)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，以培養(yǎng)出的菌絲干質(zhì)量濃度為衡量指標(biāo)，篩選出最佳的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料 由遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株。

1.2 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基配方 葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蒸餾水1 000 ml。

1.3 接種及培養(yǎng)方法 將斜面試管蛹蟲草菌株分成0.5 cm的小塊，接種于已滅菌的裝有250 ml液體培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)2次。

1.4 菌絲體生物量測(cè)定方法 采用菌絲體干質(zhì)量法，取發(fā)酵液100 ml，分裝于4個(gè)50 ml離心管中，配平后離心，3 000 r/min，備用。

1.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化方法

1.5.1 最佳碳、氮源的篩選試驗(yàn)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源采用葡萄糖、蔗糖，以20 g/L添加，以不含碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)2次；在三角瓶中分別用搖床培養(yǎng)5 d和靜置培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量濃度，通過培養(yǎng)出的菌絲體干質(zhì)量濃度的不同來比較不同碳源對(duì)其影響。選取蛋白胨、酵母浸出粉作為有機(jī)氮源進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析，以10 g/L添加，其他方法同上。

1.5.2 液體培養(yǎng)基中不同碳氮肥比（C/N）對(duì)菌株菌絲體干質(zhì)量濃度的影響。將篩選到的最佳碳源、有機(jī)氮源按2∶1、1∶2、1∶1 3種配比進(jìn)行試驗(yàn)，液體培養(yǎng)基中各成分具體加入量如表1所示，每個(gè)處理重復(fù)2次。比較不同C/N的培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量濃度的影響。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳、氮源的篩選試驗(yàn) 通過靜置培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)情況對(duì)比（圖1）可以直觀地看出，以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基三角瓶中菌絲生長(zhǎng)最密，其次是葡萄糖，不加碳源的CK菌絲生長(zhǎng)量最少，同時(shí)也說明碳源是作為液體培養(yǎng)基中的一個(gè)非常重要的營(yíng)養(yǎng)因子。從圖1可以看出最佳碳源是蔗糖。通過圖2也可以明顯看出最利于菌絲培養(yǎng)的碳源是蔗糖。

通過靜置培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)情況（圖3）可以直觀地看出，以蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基三角瓶中菌絲生長(zhǎng)最密，其次是酵母浸出粉，不加氮源的CK菌絲生長(zhǎng)量最少，幾乎沒有，同時(shí)也說明

氮源是作為液體培養(yǎng)基中的一個(gè)非常重要的營(yíng)養(yǎng)因

子。從圖3可以看出最佳氮源是蛋白胨，通過圖4也可以明顯看出最利于菌絲培養(yǎng)的氮源是蛋白胨。

從圖2和圖4也可以看出，同樣溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)的菌絲明顯高于靜置培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)量。

2.2 不同碳氮肥比（C/N）對(duì)菌株菌絲體干質(zhì)量濃度的影響 將篩選到的最佳碳源蔗糖、有機(jī)氮源蛋白胨按1∶2、2∶1、1∶1 3種配比進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得的菌絲干質(zhì)量濃度分別為4.28、6.00、5.90 g/L，經(jīng)方差分析得出，當(dāng)碳氮肥比為2∶1和1∶1時(shí)菌絲干質(zhì)量濃度無顯著差異，均得到了較高的生物量，碳氮肥比為1∶2時(shí)，菌絲干質(zhì)量濃度與其他2種碳氮比下的菌絲生長(zhǎng)量存在顯著差異，且明顯低于后兩者，所以對(duì)于遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)基的碳氮比為2∶1或1∶1情況下均利于其菌絲生長(zhǎng)，對(duì)其他蛹蟲草的液體發(fā)酵培養(yǎng)也有一定的指導(dǎo)意義。

3 討論

最佳碳、氮源的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖最有利于蛹蟲草菌絲的生長(zhǎng)，這與周廣麒等[5]的研究結(jié)果一致，而蔡友華等[6]和劉苗苗等[7]篩選出的蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源是葡萄糖，這可能與蛹蟲草菌株的性狀不同有關(guān)系；在氮源篩選試驗(yàn)中，當(dāng)液體培養(yǎng)基中未加氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)量幾乎為零，而在碳源篩選試驗(yàn)中未加碳源的情況下菌絲生長(zhǎng)量也很少但明顯高于未加氮源的培養(yǎng)基中的菌絲量，說明氮源對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵的影響較明顯，這與孫佳巖[8]的研究結(jié)果一致。

由不同碳氮肥比（C/N）對(duì)菌絲體生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)碳源所加的量相同時(shí)，氮源加量的多少對(duì)菌絲的生長(zhǎng)影響不顯著；而當(dāng)加入同樣量的氮源時(shí)，菌絲體干質(zhì)量濃度在加入不同碳源的情況下存在顯著性差異，同樣說明了碳源的重要性。

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[8] 孫佳巖.蛹蟲草液體深層發(fā)酵的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012：7-10.