熱帶海洋紅藻中總酚類化合物含量研究

安婷婷 李玲娜 王鶴

摘要 [目的]開發(fā)一種篩選高酚類化合物含量的海洋紅藻方法。[方法]對(duì)FolinDenis法測(cè)定的紅藻中總酚類化合物含量進(jìn)行了研究，通過Na2CO3溶液和FolinDenis試劑用量以及顯色時(shí)間等因素的研究，得出最佳反應(yīng)體系，同時(shí)驗(yàn)證最佳檢測(cè)條件。[結(jié)果]最優(yōu)試驗(yàn)方法為1.0 ml的樣品提取液中依次加入20 ml水、3.0 ml飽和Na2CO3溶液、5.0 ml FolinDenis試劑，搖勻，顯色70 min，在713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；紅藻的總酚類含量在0.04～0.80 mg/ml范圍內(nèi)吸光度和總酚類含量具有良好的線性關(guān)系，符合回歸方程y=1.470 5x-0.003 8（R2=0.999），平均加標(biāo)回收率為99.93%，RSD為0.62%。[結(jié)論]FolinDenis法經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、簡(jiǎn)單、快捷，可用于大量篩選高酚類含量的海洋紅藻。

關(guān)鍵詞 酚類化合物；篩選方法；紅藻

中圖分類號(hào) S986.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）34-148-02

海藻溴酚化合物為海洋生物特有的鹵代化合物，因其大多具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)及獨(dú)特的生物活性，為獲得全新結(jié)構(gòu)的新藥提供了寶貴的化合物來源，近年來逐步引起了海洋藥物研究者的注意。該類化合物在抗炎[1]、抗菌、抗氧化、抗腫瘤[2-3]、α葡萄糖苷酶抑制、蛋白酪氨酸磷脂抑制[4]等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的生物活性。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將海藻溴酚化合物作為治療糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤等重大疾病的藥物，并已獲得了發(fā)明專利或新藥批件[5-6]。

常用的體外降血糖模型α葡萄糖苷酶法所需要的對(duì)硝基苯αD葡萄糖吡喃苷、α葡萄糖苷酶價(jià)格昂貴且保存方法特殊，并不適用于篩選大量的海洋紅藻資源。該研究對(duì)FolinDenis法測(cè)定的紅藻中總酚類化合物含量進(jìn)行了研究，通過Na2CO3溶液和FolinDenis試劑用量以及顯色時(shí)間等因素的研究，得出最佳反應(yīng)體系，同時(shí)驗(yàn)證最佳檢測(cè)條件，旨在建立紅藻中總酚類化合物含量的篩選方法，為后期篩選高酚類含量的紅藻奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì) （UV2401PC）；軌道式振蕩儀（OS100）；超聲微波清洗儀（SK450HP）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL16MC）。

1.2 試劑與藥材

麒麟菜（瓊海），于2011～2013年期間采集，由海南省藥物研究所李玲娜主任鑒定；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 溴酚化合物的提取。

稱取麒麟菜粉末10 g于250 ml錐形瓶中，加入100 ml 50%的乙醇，超聲30 min，提取2次，將提取液抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至500 ml圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，向燒瓶中加入25 ml純化水，超聲30 min溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml棕色容量瓶中，定容，備用。

1.3.2 FolinDenis分光光度法測(cè)定麒麟菜中酚類物質(zhì)含量最佳試驗(yàn)條件的摸索。

1.3.2.1 對(duì)照品的選擇。稱取間苯三酚1.229 55 g于250 ml容量瓶中，加入純化水溶解，加入0.5 ml F.D試劑，于軌道式振蕩儀上130 rpm振搖30 min，加入1.0 ml飽和Na2CO3溶液，用純化水定容，避光顯色80 min，在800～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行圖譜掃描，麒麟菜樣品掃描方法同對(duì)照品。

1.3.2.2 飽和碳酸鈉溶液的用量。取數(shù)支50 ml容量瓶，各加入20 ml純化水、1.0 ml 0.2 mg/ml間苯三酚溶液、2.0 ml F.D試劑，搖勻，靜置6 min，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml飽和Na2CO3溶液，用純化水定容，搖勻，靜置避光顯色80 min，以空白試劑為參比，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.3 FolinDenis試劑的用量。取數(shù)支50 ml容量瓶，分別加入20 ml純化水、1.0 ml 0.2 mg/ml間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)液，容量瓶中依次加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml F.D試劑，搖勻，靜置6 min，分別加入3.0 ml飽和Na2CO3溶液，用純化水定容，搖勻，靜置避光顯色80 min，以空白試劑為參比，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.4 最佳顯色時(shí)間。取數(shù)支50 ml容量瓶，各加入20 ml純化水、1.0 ml 0.2 mg/ml間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)液、5.0 ml F.D試劑，搖勻，靜置6 min，分別加入3.0 ml飽和Na2CO3溶液，用純化水定容，搖勻，靜置避光顯色5、15、20、30、40、60、80、90、100、120 min，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取數(shù)支50 ml容量瓶，分別加入20 ml純化水，再分別加入0、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8 mg/ml的間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml，按最佳試驗(yàn)條件，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.6 精密度試驗(yàn)。取數(shù)支50 ml容量瓶，分別加入20 ml純化水，再加入0.2 mg/ml間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml，按最佳試驗(yàn)條件，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，做6份平行試驗(yàn)，計(jì)算RSD。

1.3.2.7 樣品中酚類化合物的測(cè)定。取數(shù)支50 ml容量瓶，分別加入20 ml純化水，再分別加入1 ml麒麟菜樣品3份，按最佳試驗(yàn)條件，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.8 回收率試驗(yàn)。取數(shù)支50 ml容量瓶，分別加入1 ml麒麟菜樣品，再依次加入0.25、0.50 mg各3份，搖勻，按最佳試驗(yàn)條件，于713 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 圖譜掃描

因間苯三酚與酚類化合物均具有苯環(huán)的相似結(jié)構(gòu)，篩選模型選用間苯三酚作為對(duì)照品，樣品光譜掃描圖譜與間苯三酚基本相同（圖1），且均在波長(zhǎng)為713 nm處有最大吸收峰，故此模型選擇713 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 飽和碳酸鈉溶液的用量和FolinDenis試劑的用量結(jié)果

通過對(duì)比不同體積的飽和碳酸鈉結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，吸光度隨著飽和碳酸鈉用量的增大而增大，當(dāng)飽和碳酸鈉的體積為3.0 ml時(shí)吸光度達(dá)最大值，顯色最完全，而后，吸光度反而隨著飽和碳酸鈉體積的增大而減小，故此模型選擇飽和碳酸鈉的用量為3.0 ml。同樣，通過FolinDenis試劑用量曲線結(jié)果（圖2）可知，F(xiàn)olinDenis試劑用量在5.0 ml時(shí)反應(yīng)體系顏色較為清亮，反應(yīng)體系最為穩(wěn)定，對(duì)吸光度的影響比較?。划?dāng)FolinDenis試劑用量超過5.0 ml時(shí)，隨用量的增加而出現(xiàn)白色沉淀，且吸光值不穩(wěn)定，因此此模型選用5.0 ml的FolinDenis試劑。

2.3 最佳顯色時(shí)間結(jié)果

由圖3可知，吸光度在60～120 min范圍內(nèi)趨向于穩(wěn)定，變化范圍小于1%，所以此模型選擇70 min 為顯色時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

由圖4可知，間苯三酚的線性方程為y=1.470 5x-0.003 8（R2=0.999），線性范圍為0.04～0.80 mg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“1.3.2.6”操作，6份平行試驗(yàn)的RSD為0.25%，表明此方法的精密度較高。

2.6 樣品中酚類化合物的測(cè)定 按“1.3.2.7”操作，3次樣品平行測(cè)定的吸光值分別為0.373、0.370、0.376，麒麟菜中總酚類化合物的含量為1.28 mg/g，RSD為0.70%。

2.7 回收率

由表1可知，加標(biāo)回收率為99.12%～100.74%，平均加標(biāo)回收率為99.93%，平均RSD為0.62%。