HPLC法測定原料乳中慶大霉素殘留的研究

趙靜，劉婷，蔡柏巖，劉鵬，錢鐳，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150066；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150086）

HPLC法測定原料乳中慶大霉素殘留的研究

趙靜1，2，劉婷1，蔡柏巖1，劉鵬2，錢鐳1，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150066；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150086）

建立測定原料奶中慶大霉素C組分的高效液相色譜法。通過加入適量沉淀劑除去樣品中大部分蛋白質(zhì)，采用鄰苯二甲醛試劑柱前衍生化，利用C18色譜柱，以含有0.02 mol/L的甲醇-醋酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用熒光檢測器檢測，激發(fā)波長340 nm、發(fā)射波長450 nm。結(jié)果表明，回收率在85.6%～97.3%，精密度（RSD）為1.21%～4.04%，最低檢出限為0.2 μg/mL。該方法可用于原料奶中慶大霉素殘留4種組分的測定。

高效液相色譜；慶大霉素；鄰苯二甲醛；柱前衍生

近年來，慶大霉素因其價(jià)格低廉易得而被廣泛的應(yīng)用于治療動(dòng)物的消化道和呼吸道疾病［1］，因此慶大霉素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留情況也越來越受到人們的廣泛關(guān)注。中國農(nóng)業(yè)部對(duì)動(dòng)物性食品中慶大霉素的最高殘留限量有明確的規(guī)定［2］，出臺(tái)了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)［3］，但方法的重復(fù)性較差，靈敏度較低，檢測時(shí)間較長，僅能檢測慶大霉素的一種成分，然而慶大霉素主要含C1、C1a、C2、C2a 4種有效組分（C組分），各組分的抗菌活性及毒性不同，其含量比例以及純度在各國藥典中都有明確規(guī)定［4］。為了方便乳及乳制品中抗生素殘留的日常監(jiān)測，需要建立能夠同時(shí)測定慶大霉素4個(gè)組分的快速簡單的檢測方法。

本方法通過沉淀樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪等干擾物質(zhì)，采用鄰苯二醛試劑柱前衍生化，用離子對(duì)反相色譜法進(jìn)行分離測定?？疾炝肆鲃?dòng)相配比、波長控制、衍生時(shí)間和溫度等衍生條件的控制，建立了梯度洗脫高效液相色譜法用于原料奶中慶大霉素殘留的檢測，11 min內(nèi)即可使慶大霉素C組分與相鄰各峰獲得良好分離，適于用于檢測機(jī)構(gòu)以及企業(yè)的快速檢驗(yàn)，并為慶大霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)提供了新的有效手段，其靈敏度高，重現(xiàn)性好。

1材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站，配Waters2475熒光檢測器：美國Waters公司；QL-901型振蕩器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Oasis MCX（mixed-modecation exchange）固相萃取柱：美國Waters公司；電子天平；離心機(jī)；氮吹儀；水浴鍋；酸度計(jì)等。

1.2 材料試劑

慶大霉素標(biāo)物質(zhì)（≥99%）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甲醇（色譜純），天津科密歐公司；正己烷；庚烷磺酸鈉；氫氧化鉀；硼酸；磷酸氫二鈉；三氯乙酸；異丙醇；鄰苯二甲醛；實(shí)驗(yàn)用水均為三級(jí)水；

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.050 mg，甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，配成1.000 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，使用時(shí)按需要制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液：稱取庚烷磺酸鈉0.809 g，用雙蒸水定容至100 mL。

硼酸緩沖液：稱取硼酸2.47 g，溶于90 mL水中，用45%KOH溶液調(diào)pH至10.4，加水定容至100 mL。

磷酸鹽緩沖液：稱取Na2HPO41.412 g，加水溶解并稀釋至100 mL。

5%三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸2.5 g，加磷酸鹽緩沖液溶解并定容至50 mL。

鄰苯二甲醛衍生劑：稱取鄰苯二甲醛0.2 g，用1 mL甲醇和19 mL硼酸緩沖液溶解，加入0.2 mL 2-巰基乙醇，用KOH調(diào)節(jié)pH至10.4，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫：30℃；檢測器：熒光檢測器：激發(fā)波長340 nm、發(fā)射波長450 nm；流動(dòng)相：含有0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液的甲醇-醋酸（200∶5體積比）溶液；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 提取

稱取室溫解凍的牛奶樣品5 mL置于50 mL離心管中，加入2 mL的5%三氯乙酸溶液，于旋渦混合器上混勻2 min，以6 000 r/min離心10 min。分出上清液，沉淀再加入2 mL 5%三氯乙酸溶液，重復(fù)上述操作一次，合并上清液，加入2 mL正己烷脫脂，于旋渦混合器上混勻，靜止1 min，以6 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層，加入2 mL 0.05 mol/L的庚烷磺酸鈉溶液，混勻后供固相萃取柱凈化。

1.3.2.2 凈化

依次用甲醇、水和庚烷磺酸鈉緩沖液各3 mL活化固相萃取柱，取上述樣品上樣，待樣品全部流出后，分別用2 mL 0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液和2 mL水淋洗，棄去全部流出液，固相萃取柱真空抽干1 min。最后用體積比為55∶45的乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液2 mL洗脫，收集洗脫液于指形瓶中。

1.3.2.3 濃縮與富集

將凈化時(shí)收集的洗脫液在60℃下用氮吹儀濃縮至近干，用甲醇-水（6∶4，體積比）2 mL溶液溶解殘?jiān)?/p>

1.3.2.4 柱前衍生化

濃縮后的樣品加入2 mL異丙醇后加入1 mL的鄰苯二甲醛（OPA）衍生劑混勻，50℃水浴20 min后，冷卻至室溫，取10 μL樣品過膜后，供高效液相色譜測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次稀釋為5、25、50、75、100、200、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，柱前衍生化處理后，取10 uL進(jìn)樣，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度水平為橫坐標(biāo)，以待測物色譜圖的平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 方法的專屬性

分別取3組空白奶樣，按樣品處理方法項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10 μL，獲得空白樣品的色譜圖，將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白基質(zhì)中，依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖，將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖。

1.3.5 精密度和準(zhǔn)確度的測定

分別在同一天和連續(xù)5 d制備濃度為25、100、500 μg/mL的慶大霉素原料奶樣品，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，根據(jù)日內(nèi)與日間變異系數(shù)評(píng)價(jià)方法的精密度和準(zhǔn)確度。

1.3.6 回收率

配制標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為25、100、500 μg/mL的慶大霉素原料奶樣品，每一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，取10 μL進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)的峰面積，以每一濃度處理的樣品與理論添加標(biāo)準(zhǔn)品量的比值計(jì)算方法回收率。

1.3.7 靈敏度

向空白奶樣中添加不同濃度的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比S/N=3時(shí)的最低濃度為最低定性檢測限，S/ N=10時(shí)的最低濃度為最低定量檢測限。

2結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

用于慶大霉素檢測是色譜柱主要有C18和C8 2種，本實(shí)驗(yàn)中選擇C18柱，由于慶大霉素具有極性和離子特征，它通常在反相色譜柱上不易分離，因此在本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相中加入了醋酸緩沖液，以改善慶大各組分在C18柱上的分配性能［5-6］。

農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-7-2009采用了梯度洗脫的方式進(jìn)行測定慶大霉素，結(jié)果只能檢測慶大霉素一種成分［3］。朱立勒等采用了甲醇：0.01 mg/L的醋酸銨緩沖液pH=7為流動(dòng)相，以威替米星為內(nèi)標(biāo)物建立了硫酸慶大霉素血清樣品的高效液相色譜檢測法，該方法中雖然硫酸慶大霉素的C1a，C2，C2a三組分被較好的分離出來，但其最低檢測限較高［7］。王春艷等以甲醇-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液為流動(dòng)相，較好地分離了慶大霉素的4個(gè)成分，但是檢測限較高［8］。本實(shí)驗(yàn)以含有0.02 mol/L庚烷磺酸鈉溶液的甲醇-醋酸（200∶5體積比）溶液為流動(dòng)相，不僅可以檢測出慶大霉素4種成分，而且檢測限較低。

2.2 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將慶大霉素儲(chǔ)備液稀釋以后，進(jìn)行檢測得出了慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1，在慶大霉素濃度為5 μg/mL～500 μg/mL期間，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。

圖1 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard Curve of Gentamicin

2.3 方法專屬性

圖2是慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖。

圖2 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖Fig.2Chromatogram of Gentamicin Working Solution

從圖2中我們可以清楚看到慶大霉素4個(gè)組分（C1、C1a、C2、C2a）得到很好地分離，并且圖形尖銳，4個(gè)組分的保留時(shí)間分別為2.828、9.086、9.536、9.718 min。圖3、圖4分別是空白奶樣色譜圖和空白奶樣加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

由圖3和圖4可以看出，慶大霉素的4個(gè)組分分離良好，奶樣中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品無干擾，本實(shí)驗(yàn)以C1的含量為標(biāo)準(zhǔn)來確定慶大霉素的含量。

圖3 空白奶樣色譜圖Fig.3Chromatogram of Blank Sample

圖4 空白奶樣加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4Chromatogram of Blank Milk Sample with Gentamicin standard sample

2.4 精密度和準(zhǔn)確度的測定

精密度和準(zhǔn)確度的測定見表1。

表1 慶大霉素在牛奶中的精密度和準(zhǔn)確度Table 1Precision and Accuracy of Gentamicin

由表1可知，在牛奶中慶大霉素高、中、低濃度的日內(nèi)精度均小于5%，日間精度均小于5%。

2.5 方法回收率

在牛奶中添加慶大霉素，所測的回收率數(shù)據(jù)見表2。

表2 牛奶中慶大霉素的方法回收率Table 2Recovery Rate of Gentamicin

從表2中可以看出該方法在慶大霉素濃度為25、100μg/mL和500μg/mL時(shí)平均回收率為86.3%、87.5%和91.4%，總回收率為88.72%，回收率均符合測定要求。

2.6靈敏度測定

根據(jù)信噪比（S/N）的值來確定最低定性檢測限和最低定量檢測限，結(jié)果表明該方法最低定性檢出限為0.1 μg/mL，定量檢出限為0.2 μg/mL。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以含有0.02 mol/L的甲醇-醋酸溶液為流動(dòng)相，采用鄰苯二甲醛試劑柱前衍生，利用C18色譜柱進(jìn)行分離檢測，可以較好地檢測出慶大霉素4個(gè)組分C1、C1a、C2、C2a。通過該方法可以較快地將慶大霉素檢測出來，同時(shí)4個(gè)組分峰形良好，該方法靈敏度較高，最低定量檢測限為0.2 μg/mL，定性檢測限為0.1 μg/mL，通過該方法的建立縮短了乳中慶大霉素檢測時(shí)間，同時(shí)又可以快速檢測慶大霉素的4個(gè)組分，所以該方法更適合乳中慶大霉素的檢測。

［1］王丹，許楊，何慶華，等.Elispot assay檢測牛奶中慶大霉素［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（2）：224-227

［2］陳一資，胡濱.動(dòng)物性食品中獸藥殘留的危害及其原因分析［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：162-166

［3］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告動(dòng)物性食品中慶大霉素殘留檢測高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009

［4］劉承偉，羅志輝，陸尉天，等.HPLC-共振瑞利散射聯(lián)用測定慶大霉素各組分［J］.廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010（3）：37-41

［5］侯亞莉，朱奎，郭平，等.高效液相色譜法測定牛肌肉中慶大霉素殘留的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（6）：102-106

［6］侯亞莉，蘇亮，丁平，等.慶大霉素的殘留檢測方法［J］.中國飼料，2007，12（1）：1-3

［7］朱立勤.氨基糖苷類抗生素時(shí)辰給藥方案的實(shí)驗(yàn)研究［D］.天津醫(yī)科大學(xué)，2005

［8］王春艷，李艷華，張秀英.檢測豬血漿中林可霉素和慶大霉素濃度的HPLC方法的建立［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（12）：39-44

Determination of Gentamicin in Raw Milk by High-performance Liquid Chromatopraphy

ZHAO Jing1，2，LIU Ting1，CAI Bai-yan1，LIU Peng2，QIAN Lei1，*
（1.Food and Environmental Engineering Department，Heilongjiang East College，Harbin 150066，Heilongjiang，China；2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

To establish a HPLC method for determination of gentamicin in the raw milk.Protein in milk were mostly eliminated by the precipitators，OPA was used for derivatization，and then separated on C18 column witha mixed solution of methanol-acetic acid as mobile phase，and excitation and emission wavelength are 340 nm and 450 nm with a fluorescence detector The recovery were 85.6%-97.3%，the relative standard deviations（RSD）were 1.21%-4.04%，the minimum detectable values were 0.2 μg/mL.This method can be used for the routine analysis of gentamicin in raw milk.

high-performance liquid chromatopraphy；gentamicin；OPA；precolumn derivatization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.026

2013-11-18

黑龍江省高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：1253G048）

趙靜（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：乳品質(zhì)量與安全。

*通信作者：錢鐳（1981—），男（漢），副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。