雙孢菇廢棄菇柄核酸超聲提取工藝優(yōu)化

李順峰，沈琪，，謝新華，王安建，*，侯傳偉，魏書信

（1.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002）

雙孢菇廢棄菇柄核酸超聲提取工藝優(yōu)化

李順峰1，沈琪1，2，謝新華2，王安建1，*，侯傳偉1，魏書信1

（1.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002）

為了提高核酸得率，增加雙孢菇廢棄菇柄的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文以雙孢菇廢棄菇柄為原料，通過單因素試驗(yàn)研究了超聲功率、超聲工作/間歇時(shí)間、超聲時(shí)間、液固比對(duì)核酸提取的影響，并采用響應(yīng)面法對(duì)核酸超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，再采用響應(yīng)面分析法對(duì)主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到雙孢菇廢棄菇柄中核酸提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超聲時(shí)間15 min，理論核酸得率3.49 g/100 g。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際核酸得率可達(dá)3.43 g/100 g，實(shí)驗(yàn)證明模型擬合程度良好，誤差較小。與傳統(tǒng)工藝相比，超聲波提取核酸不僅快速高效，且反應(yīng)過程無物料損失和無副反應(yīng)發(fā)生，是一種安全、經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便的提取方法。

雙孢菇廢棄菇柄；核酸；超聲提取；響應(yīng)面分析法

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬大型真菌，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值［1-3］，享有“素中之王”的美稱，是我國目前出口量最大、創(chuàng)匯最高的一種食用真菌。然而，在雙孢菇加工過程中大量的菇柄作為廢棄物被丟棄，既污染環(huán)境又造成了資源的浪費(fèi)。雙孢菇菇柄與其菇蓋一樣富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、核酸、核苷酸等成分［2，4-5］，因此對(duì)廢棄菇柄進(jìn)行綜合開發(fā)利用，可提高雙孢菇的采后價(jià)值。

目前，國內(nèi)外對(duì)雙孢菇的研究大多是多糖、蛋白、脂肪等有效成分的提取、分離及功能性質(zhì)的測(cè)定，對(duì)于雙孢菇核酸和核苷酸方面的研究還比較少。核酸是一種生物大分子物質(zhì)，可分為脫氧核糖核酸和核糖核酸［6］，核酸酶解后的核苷酸是食用菌中主要的呈味物質(zhì)。測(cè)定核酸的方法有定磷法［7］、地衣酚法［8］、紫外吸收法［8］、熒光光度法［9］、高效液相色譜法［10］、毛細(xì)管電泳法［11］等。定磷法準(zhǔn)確性好，靈敏度高，最低可以測(cè)到10 ug/mL核酸的水平［1］。近年來，超聲波技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物中的蛋白質(zhì)、酶、多糖、生物堿、蒽醌、油脂、黃酮類、苷類等生物活性物質(zhì)的提?。?2-16］，其原理是超聲波處理過程中，“空化效應(yīng)”釋放巨大能量，產(chǎn)生高達(dá)幾百個(gè)大氣壓的局部瞬間壓力，形成沖擊波，使固體表面及液體介質(zhì)受到極大的沖擊力，能量足以使細(xì)胞破裂以達(dá)到破壁的目的［12］，使溶劑能和植物中的有效成分充分接觸，有利于有效成分向提取溶劑轉(zhuǎn)移，提高提取效率。該方法操作簡(jiǎn)單，副產(chǎn)品少，提取物易分離，不破壞有效成分能達(dá)到比常規(guī)提取法更理想的結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)以雙孢菇菇柄為原料，采用超聲法提取菇柄中核酸，定磷法測(cè)定核酸含量，以研究菇柄核酸提取率的最佳工藝。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢菇廢棄菇柄購于長垣；磷酸二氫鉀、濃硫酸、氯仿、鉬酸銨、抗壞血酸、硝酸、30%過氧化氫、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器

GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠提供；萬能粉碎機(jī)：上海金剛電器廠；精密電子天平：常州萬泰天平儀器有限公司；H2050R型高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司提供；UV-2802型紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；HN-1000Y超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：上海汗諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸的定量測(cè)定［17］

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)磷溶液

精密稱取在105℃烘至恒重的磷酸二氫鉀0.877 5 g，溶于少量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，加入5 mL 5 mol/L硫酸溶液及氯仿數(shù)滴，用蒸餾水稀釋至刻度，此溶液每毫升含磷400 μg。臨用時(shí)準(zhǔn)確稀釋20倍（20 μg/mL）。

1.3.1.2 定磷試劑

17%硫酸∶2.5%鉬酸銨∶10%抗壞血酸∶水=1∶ 1∶1∶2，臨用時(shí)按順序配制，當(dāng)天配制當(dāng)天使用。

1.3.1.3 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取12支干試管，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，相當(dāng)于每份的磷含量分別為0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg，加水補(bǔ)至3 mL，搖勻至45℃水浴中保溫10 min，冷卻至室溫，于660 nm處測(cè)吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），回歸方程為：y=0.045 6x-0.001 4（R2=0.999 9）。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Phosphorus standard curve

1.3.1.4 無機(jī)磷的測(cè)定

吸取樣液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取3.0 mL置于試管中，加定磷試劑3.0 mL，45℃水浴保溫10 min，冷卻，測(cè)A660nm。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷含量。

1.3.1.5 總磷的測(cè)定

取樣液1.0 mL于試管中，再加1.0 mL濃硫酸，放入150℃的烘箱中消化，在溶液變黑之后各滴加兩滴HNO3和30%的H2O2，繼續(xù)消化至透明，表明消化完成。冷卻至室溫后將消化液移入100 mL容量瓶中，并定容至刻度，其余步驟同1.3.1.4。

1.3.1.6 計(jì)算

樣品中核酸得率按下式計(jì)算［7］。

式中：m1為樣品中有機(jī)磷含量，μg，有機(jī)磷含量=總磷含量－無機(jī)磷含量；m為樣品重量，g；N為稀釋倍數(shù)；11為1 μg磷相當(dāng)于11 μg核酸。

1.3.2 雙孢菇廢棄菇柄核酸的提取

精確稱取干燥粉碎后的菇柄粉2.0 g，按一定液固比加入蒸餾水后進(jìn)行超聲處理，提取一定時(shí)間后以4 500 r/min離心10min，取上清液測(cè)定核酸含量。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以雙孢菇廢棄菇柄為材料，考察不同超聲功率（200、300、400、500、600、700、800 W）、液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）、超聲工作/間歇時(shí)間（1、2、3、4、5 s）、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）對(duì)廢棄菇柄核酸提取效果的影響，每個(gè)條件進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Central Composite中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲功率、液固比、超聲時(shí)間3個(gè)因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行3因素3水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并運(yùn)用Design Expert 7.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而得到最佳的生產(chǎn)工藝條件，因素水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1Factors and code levels of experiments

2結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸提取的影響

在液固比30∶1 mL/g，超聲工作/間歇時(shí)間3 s，超聲功率分別為200、300、400、500、600、700、800 W下超聲10 min結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲功率對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率的影響Fig.2Effect of ultrasonic power on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

超聲功率從200 W到600 W，雙孢菇廢棄菇柄核酸得率不斷增加，并在600 W時(shí)達(dá)到最大3.21 g/100 g；當(dāng)超聲功率大于600 W時(shí)，核酸得率反而下降，可能在超聲功率過大時(shí)，破壞核酸的分子結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致核酸得率下降。

2.1.2 液固比對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸提取的影響

在超聲功率600 W，超聲工作/間歇時(shí)間3 s，液固比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g下超聲10 min，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著液固比的增加，核酸得率增大，且各個(gè)水平之間效果顯著，但隨著液固比的增加，后續(xù)濃縮工藝需要更長的時(shí)間。綜合考慮，選取液固比為30∶1mL/g。

圖3 液固比對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率的影響Fig.3Effect of ratio of liquid to solid on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.3 超聲工作/間歇時(shí)間對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸提取的影響

在超聲功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超聲工作/間歇時(shí)間分別為1、2、3、4、5 s下超聲10 min，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲工作/間歇時(shí)間對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率的影響Fig.4Effect of ultrasonic work-pause time on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

隨著超聲工作/間歇時(shí)間的延長核酸得率呈增大的趨勢(shì)，但各時(shí)間之間效果并不顯著，所以選取5 s為最優(yōu)條件。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸提取的影響

在超聲功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超聲工作/間歇時(shí)間5 s下，分別超聲5、10、15、20、25、30 min，核酸測(cè)定結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率的影響Fig.5Effect of ultrasonic time on the yield of nucleic acids from Agaricus bisporus waste stipe

從圖5可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，核酸得率逐漸增大，在超聲時(shí)間達(dá)20 min時(shí)達(dá)到最大，之后降低。這可能是隨著超聲時(shí)間的延長，產(chǎn)生較多的熱量，造成核酸的破壞，從而導(dǎo)致得率的降低，這與崔茉莉［18］等研究的微波時(shí)間過長，熱效應(yīng)造成核糖核酸類物質(zhì)得率降低相一致。在超聲時(shí)間由5 min延長至10 min時(shí)，核酸得率由2.13 g/100 g增加到3.11 g/100g，達(dá)到顯著水平，之后再延長超聲時(shí)間（至20min），核酸得率增加緩慢，與超聲10 min時(shí)無顯著差異，因此選擇超聲時(shí)間為10 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化雙孢菇廢棄菇柄核酸提取工藝參數(shù)2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以核酸得率（Y）為考察目標(biāo)做響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Design and results of experiments

2.2.2 回歸方程的方差分析

用Design Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到雙孢菇菇柄核酸提得率Y對(duì)A、B、C的回歸方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。模型p＜0.01，表明該二次方程模型比較顯著。失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），方程擬合較好，可以對(duì)不同條件下的核酸提取得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。從F值A(chǔ)、B、C可以看出，在所選的因素水平范圍內(nèi)，對(duì)雙孢菇菇柄核酸得率的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間＞液固比＞超聲功率。模型中一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)B、C處于極顯著水平；一次項(xiàng)B，二次A，交互項(xiàng)BC處于顯著水平；一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、AC不顯著。兩因素間交互作用分析的響應(yīng)面見圖6。

圖6表示超聲功率600 W，液固比和超聲時(shí)間對(duì)核酸得率的影響。當(dāng)超聲時(shí)間小于10 min時(shí)，核酸得率隨液固比的增加先增大后減??；當(dāng)超聲時(shí)間大于10 min時(shí)，核酸得率隨液固比的增加而增大。當(dāng)液固比一定時(shí)，核酸得率隨超聲時(shí)間的延長而增加，當(dāng)超聲時(shí)間在5 min～10 min范圍時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，核酸得率增加較快；當(dāng)超聲時(shí)間在10 min～15 min范圍時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，核酸得率增加較慢。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3Variance analysis of experimental results

圖6 液固比與超聲時(shí)間對(duì)核酸得率的交互作用Fig.6Interaction of liquid to solid and ultrasonic time on the yield of nucleic acid

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用Design Expert 8.0軟件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，考慮到試驗(yàn)操作的便利，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為超聲功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超聲時(shí)間15 min，預(yù)測(cè)雙孢菇廢棄菇柄核酸的得率為3.49 g/100 g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，實(shí)際得率分別為3.34、3.46、3.49 g/100 g，實(shí)際得率平均值為3.43g/100g。與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)偏差約為0.87%，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率。

3討論與結(jié)論

3.1 討論

目前常用于提取核酸的方法主要有：氨法［19］和濃鹽法［20］。選取氨法提取條件［21］：氨質(zhì)量濃度1%，破壁溫度60℃，破壁時(shí)間60 min，原料質(zhì)量濃度10%；濃鹽法提取條件［21］：鹽質(zhì)量濃度10%，破壁溫度95℃，破壁時(shí)間120 min，原料質(zhì)量濃度10%。采用上述提取條件，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，氨法所得核酸得率為2.92 g/100 g，濃鹽法所得核酸得率為2.04 g/100 g。氨法提取所得核酸的顏色較深，且純度遠(yuǎn)小于另外兩種方法；濃鹽法則由于加入NaCl，需要在實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)行脫鹽處理，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程過于繁瑣，且提取率也遠(yuǎn)低于其他方法。雖然超聲提取過程中會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，但雙孢菇廢棄菇柄的得率為3.43 g/100 g，仍高于前2種方法，說明熱效應(yīng)的強(qiáng)弱與超聲波作用的參數(shù)及作用的對(duì)象密切相關(guān)［22］。故與傳統(tǒng)工藝相比，超聲波提取操作簡(jiǎn)單、安全、高效、快速，反應(yīng)過程無物料損失和無副反應(yīng)發(fā)生，可用于多種有效物質(zhì)提取。

3.2 結(jié)論

1）利用超聲波法提取雙孢菇菇柄中的核酸，通過單因素試驗(yàn)得到，超聲功率600 W，液固比30∶1 mL/g，超聲工作/間歇時(shí)間5 s，超聲時(shí)間10 min時(shí)核酸得率最顯著，再采用響應(yīng)面分析法對(duì)主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率580 W，液固比34∶1 mL/g，超聲時(shí)間15 min，通過響應(yīng)面分析可知，對(duì)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間＞液固比＞超聲功率，理論核酸得率3.49 g/100 g。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際核酸得率可達(dá)3.43 g/100 g，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)偏差約為0.87%，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)雙孢菇廢棄菇柄核酸得率。

2）與傳統(tǒng)提取核酸的氨法和濃鹽法相比，超聲波提取操作簡(jiǎn)單、高效、快速，反應(yīng)過程無物料損失和無副反應(yīng)發(fā)生，可用于多種有效物質(zhì)提取。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Nucleic Acid from Agaricus bisporus Waste Stipe

LI Shun-feng1，SHEN Qi1，2，XIE Xin-hua2，WANG An-jian1，*，HOU Chuan-wei1，WEI Shu-xin1
（1.Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.Institute of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，Henan，China）

To improve the yield of nucleic acid，increase the economic value of Agaricus bisporus waste stipe. Nucleic acid were extracted from Agaricus bisporus waste stipe by ultrasonic extraction.The effects of ultrasonic power，ultrasonic work/time，ultrasonic time，ratio of liquid to solid on the yield of nucleic acid were investigated by single factor experiments，and optimized the parameters by response surface analysis.The results showed that on the basis of single factor experiments，the parameters of ultrasonic extraction optimized by response surface analysis were as follows：ultrasonic power 580 W，liquid-solid ratio 34∶1 mL/g，ultrasonic time 15 min.Under these optimum conditions，the yield of nucleic acid extract from Agaricus bisporus waste stipe can be up to 3.43 g/100 g of which slightly lower than the theoretical yield（3.49 g/100 g）.This results indicated that the regression model could predict the yield of nucleic acid of from Agaricus bisporus waste stipe well.As compared with the traditional process，the ultrasonic extraction of nucleic acid，not only fast and efficient，but also no material loss and adverse reaction process，was a kind of security，economic and simple extraction method.

Agaricus bisporus waste stipe；nucleic acid；ultrasonic extract；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.013

2013-12-29

河南省重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（112101110300）

李順峰（1982—），男（漢），博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究。

*通信作者：王安建（1969—），男（漢），副研究員，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏保鮮。