重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)研究

王嵐，劉新，張帆，肖純凌

（1.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級(jí)2班）

重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)研究

王嵐1，2，劉新1，2，張帆3，肖純凌1*

（1.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級(jí)2班）

目的：構(gòu)建人銅鋅超氧化物歧化酶（hCu，Zn-SOD）原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)，純化及鑒定目的蛋白，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：根據(jù)已報(bào)道的hCu，Zn-SOD基因序列，采用RT-PCR技術(shù)從外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中獲得SOD cDNA序列。將所得的PCR產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pET22b（+）中，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta（DE3），通過(guò)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，經(jīng)鎳固定金屬親和層析純化。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD生物學(xué)活性。結(jié)果：序列分析表明SOD基因成熟肽編碼區(qū)含有465 bp與GenBank（X02317）中已報(bào)道序列一致的SOD核苷酸。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析顯示表達(dá)的目的蛋白分子量約為19 kD，免疫印跡分析顯示其與商品化的His-tag抗體呈特異性反應(yīng)，但主要以包涵體形式表達(dá)，可溶性蛋白表達(dá)量很少。經(jīng)Ni2+-NTA瓊脂糖純化獲得SDSPAGE電泳下單一條帶?？扇艿鞍酌富盍?60 U/ml（SOD的酶比活力為630 U/mg）。結(jié)論：在大腸桿菌中獲得了人源SOD的高效表達(dá)，為研究其生物學(xué)功能及廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

超氧化物歧化酶；大腸桿菌；表達(dá)

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是體內(nèi)抗氧化物酶系的主要成員之一，廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物以及一些微生物體內(nèi)，由蛋白質(zhì)和金屬離子組成。1938年Mann等［1］首次從牛紅細(xì)胞中得到一種含銅蛋白-血銅蛋白，1969年MeCord等［2］發(fā)現(xiàn)此蛋白能夠使超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，證實(shí)其具有清除生物體內(nèi)氧自由基的特異性生物活性，因而將其定名為SOD并受到廣泛重視，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。因此，本研究擬將人源SOD基因克隆并表達(dá)于大腸桿菌中，以提高其表達(dá)量，不僅有著重要的理論意義，而且具有重要的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 大腸桿菌E.coli DH5a菌株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供，Rosseta（DE3）感受態(tài)菌株購(gòu)自北京康為世紀(jì)科技有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b（+）由沈陽(yáng)化工學(xué)院研究所提供；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I，Hind III及T4 DNA連接酶（美國(guó)Promega公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；鎳離子親和層析柱（英國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（日本Takara公司）；SOD活性測(cè)定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 寡核苷酸引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank（X02317）的hCu，Zn-SOD的cDNA序列，設(shè)計(jì)編碼該基因片段的5′和3′端寡核苷酸引物，引物序列P1：5′-CGGAATTC TTGGGCGATCCCAATTAC-3′（劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。委托大連寶生物工程公司合成。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序 Trizol試劑從經(jīng)IL-2刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR得到hCu，Zn-SOD基因雙鏈DNA，PCR參數(shù)：98℃5 min；98℃30 s，59℃30 s，72℃15 s，循環(huán)次數(shù)30次；72℃5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物，將純化后PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體pET22b（+），構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b-SOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5a，經(jīng)過(guò)抗性篩選、酶切鑒定、PCR鑒定，初篩陽(yáng)性克隆菌株。委托大連寶生物工程公司測(cè)序。

1.4 表達(dá)菌株的構(gòu)建 提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET22b-SOD，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rosseta（DE3），抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.5 pET22b-SOD的誘導(dǎo)表達(dá) 挑選4個(gè)重組菌單菌落分別接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基37℃，160 r/min振搖過(guò)夜，次日以1∶100接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，230 r/min異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）培養(yǎng)至吸光度600值為0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，0.1 mmol/L ZnSO4，0.1 mmol/L CuSO4，于37℃ GCCACCATGGCGACGAAGGCCGTG-3′（劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；P2：5′-CCAAGCTT誘導(dǎo)表達(dá)4 h，4℃12 000 r/min IPTG離心15 min收集菌體，溶于1 ml PBS中，用超聲儀300 W超聲1 h，13 000 r/min離心15 min，取上清，沉淀加入10倍體積8 mol/L尿素溶解，各取30 μl進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.6 可溶性SOD表達(dá)條件優(yōu)化 對(duì)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET22b-SOD的DE3菌株進(jìn)行小誘條件摸索，特別是不同誘導(dǎo)溫度（37℃、20℃）及不同誘導(dǎo)時(shí)間，用SDS-PAGE分析結(jié)果。

1.7 Western blotting分析 將上述37℃對(duì)照組和處理組裂解上清及沉淀，同時(shí)將20℃過(guò)夜誘導(dǎo)對(duì)照組和處理組樣品裂解上清及沉淀，各取20 μl進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證。

1.8 目的蛋白純化和復(fù)性 按照上述最佳誘導(dǎo)條件培養(yǎng)50 ml工程菌后，超聲破碎收集上清液（400 W，破5 s，停5 s，反復(fù)30個(gè)循環(huán)），4℃12 000 r/min離心20 min后獲得蛋白的包涵體。將蛋白包涵體用變性裂解緩沖液重懸，鎳凝膠親和層析純化目的蛋白，洗脫的蛋白采用氧化型/還原型谷胱甘肽體系進(jìn)行復(fù)性。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物生物活性測(cè)定 收集復(fù)性、濃縮后的目的蛋白溶液，測(cè)定總體積并使用BCA蛋白測(cè)試試劑盒測(cè)定蛋白含量。利用SOD活性測(cè)定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）測(cè)定重組蛋白的生物學(xué)活性。

2 結(jié)果

2.1 hCu，Zn-SOD基因的克隆及測(cè)序結(jié)果 RTPCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約465 bp處有與預(yù)期大小一致的DNA條帶，測(cè)序結(jié)果（DNA序列測(cè)序號(hào)ccs2370）與GenBank（X02317）報(bào)道一致，見(jiàn)圖2。

圖1 SOD的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質(zhì)粒pET22b-SOD中SOD基因的測(cè)序結(jié)果比對(duì)

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行PCR并經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后均產(chǎn)生預(yù)期大小的目的片段，見(jiàn)圖3、4。

圖3 pET22b-SOD菌落PCR結(jié)果

2.3 重組蛋白的表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosseta（DE3）后，小誘條件摸索：結(jié)果表明SOD在無(wú)誘導(dǎo)情況下即可表達(dá)，且主要以包涵體形式（沉淀）存在，見(jiàn)圖5。

為驗(yàn)證目的蛋白是否表達(dá)，并提高可溶性蛋白的表達(dá)量。將上述37℃對(duì)照組和處理組裂解上清及沉淀，同時(shí)將誘導(dǎo)溫度降至20℃，過(guò)夜誘導(dǎo)對(duì)照組和處理組樣品裂解上清及沉淀，各取20 μl進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明pET22b-SOD最佳表達(dá)條件為：0.1 mmol/L IPTG，0.1 mmol/L ZnSO4，0.1 Mmol/L CuSO4，20℃過(guò)夜誘導(dǎo)，可溶性蛋白表達(dá)量較37℃有所提高，見(jiàn)圖6。

圖5 pET22b-SOD 37℃誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

圖6 Western blotting檢測(cè)不同溫度誘導(dǎo)下SOD的表達(dá)

2.4 鎳凝膠純化目的蛋白 經(jīng)超聲破碎離心后獲得的包涵體用變性裂解緩沖液重懸，使包涵體變性可溶。包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化，將上清液過(guò)濾后，與親和層析介質(zhì)充分結(jié)合，宿主菌Rosseta（DE3）多數(shù)雜蛋白因不與Ni2+結(jié)合用1×Binding Buffer沖洗時(shí)直接從柱中流出，再分別以含20 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L咪唑的Eluting Buffer洗脫其余雜蛋白，重組蛋白由于具有His-tag，與Ni2+-螯合親合柱的結(jié)合力最強(qiáng)，在咪唑濃度達(dá)到500 mmol/L時(shí)被洗脫，見(jiàn)圖7。

圖7 SDS-PAGE分析親和層析純化SOD表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)果

2.5 表達(dá)蛋白SOD含量及生物活性測(cè)定 將經(jīng)親和層析純化后的重組蛋白液收集到透析袋中，浸入6 mol/L尿素復(fù)性液中，同時(shí)加入還原/氧化型谷胱甘肽（reduced/oxidized glutathione，GSH/ GSSG），經(jīng)過(guò)逐步降低尿素濃度，最后用PBS透析得到含有生物活性的目的蛋白。BCA蛋白測(cè)試試劑盒測(cè)定純化蛋白含量為0.73 mg/ml，經(jīng)SOD檢測(cè)試劑盒利用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定可溶性蛋白酶的活性，得出可溶蛋白酶活力達(dá)460 U/ml（SOD的酶比活為630 U/mg）。

3 討論

近幾十年，SOD一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，其研究大多集中于從動(dòng)物血液或臟器中提取SOD，由于含有各種難以消除的病毒及外源污染，歐盟已于1999年頒布法令，禁止從動(dòng)物血液中提取的SOD用于人類(lèi)。而從植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制約，且成本較高。微生物具有原料便宜易得，可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，因而，近些年很多學(xué)者都致力于用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究［3］。目前，國(guó)內(nèi)外在微生物SOD的菌種選育、發(fā)酵工藝、分離提純、生理學(xué)研究、基因克隆表達(dá)及SOD應(yīng)用方面都取得一定的研究進(jìn)展［4-5］。

大腸桿菌基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定，本研究將人銅鋅SOD基因克隆并表達(dá)于大腸桿菌中，雖然獲得高效表達(dá)，但主要以包涵體形式表達(dá)，可溶性蛋白表達(dá)量很少。原因可能是大腸桿菌表達(dá)外源基因存在以下問(wèn)題：（1）缺乏對(duì)真核生物蛋白的修飾加工系統(tǒng)；（2）內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；（3）細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有較多的內(nèi)毒素。在商業(yè)應(yīng)用中很多的蛋白產(chǎn)物是真核基因編碼，并且具有高級(jí)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細(xì)胞的分子環(huán)境和折疊機(jī)制等與真核細(xì)胞具有很大的差異，所以在應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)真核基因時(shí)有必要利用代謝工程或進(jìn)化的方法改造細(xì)胞，解決大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性，提高產(chǎn)物的活性［6］。

由于受到（1）半衰期短；（2）相對(duì)分子質(zhì)量大，不易透過(guò)細(xì)胞膜；（3）口服時(shí)易受胃蛋白酶分解；（4）體內(nèi)特異性等因素的限制，SOD很難作為藥用酶廣泛應(yīng)用于臨床中［7］。因此，希望在不久的將來(lái)能合成出具有精確活性中心結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)穩(wěn)定的和動(dòng)力學(xué)惰性的模擬物，從而使SOD作為一種高效、安全的功能因子在產(chǎn)業(yè)中擁有廣泛的實(shí)用前景。

［1］MannT，Keilin D.Haemocuprein and hepatocuprein，copper-protein compounds of blood and liver in mammals［J］.Proc R Soc B，1938，126（844）：303-315.

［2］MeCord JM，Irwin F.Superoxide dismutase：an enzymatic function for erythrocuprein（hemocuprein）［J］.J Biol Chem，1969，244：6049-6055.

［3］張欣.超氧化物歧化酶（SOD）及其研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古石油化工，2010，（16）：14-15.

［4］王素芳，蔣琳蘭，趙樹(shù)進(jìn).微生物超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展［J］.藥物生物技術(shù)，2002，9（6）：378-380.

［5］楊明琰，張曉琦.微生物產(chǎn)超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2004，24（1）：49-51.

［6］戎晶晶，刁振宇，周?chē)?guó)華.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12（6）：416-420.

［7］馬曉麗.超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展［J］.山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，20（1）：83-86.

Expression of Recombinant Human Superoxide Dismutase in Escherichia coli

WANG Lan1，2，LIU Xin1，2，ZHANG Fan3，XIAO Chunling1*
（1.Key laboratory of Environmental Pollution and Microecology，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathogenic Biology，Shenyang Medical College；3.Grade 2011 Class 2，Shenyang Medical College）

Objective：To construct human copper zinc superoxide dismutase（hCu，Zn-SOD）prokaryotic expression vector and to purify and identify in order to lay the foundation of clinical application.Methods：RT-PCR technology was used to amplify SOD cDNA according to the reported sequence of hCu，Zn-SOD gene derived from peripheral blood mononuclear cells（PBMC）.The resulting PCR product was inserted into the prokaryotic expression vector pET22b（+）.The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosseta（DE3）after verifing by enzyme digestion，PCR and sequencing identification.The target protein was expressed by IPTG induction and purified by nickel affinity immobilized metal chromatography.The biological activity of SOD was determined by xanthine oxidase method.Results：Sequence analysis showed that 465 bp nucleotide in mature peptide encoding region was consistent with SOD sequence reported in GenBank（X02317）.After induced by IPTG and SDS-PAGE electrophoresis analysis，the recombinant protein was expressed and molecular weight was about 19 kD.But soluble protein expression was rarely and mainly in the form of inclusion body expression.The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA agarose.Biological activity of soluble protease was 460 U/ml（SOD specific activity was 630 U/mg）.Conclusion：High expression of human SOD is obtained from Escherichia coli，which laid the foundation for the study on its biological functions and wide application.

superoxide dismutase（SOD）；Escherichia coli；expression

Q786

A

1008-2344（2015）02-0070-04 doi：10.3969/j.issn.1008-2344.2015.02.002

2015-02-07

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目（No.20146069）

王嵐（1976—），女（漢），副教授，醫(yī)學(xué)博士.研究方向：院內(nèi)感染細(xì)菌耐藥機(jī)制研究.E-mail：wanglan1123@ aliyun.com

肖純凌（1964—），女（漢），教授，博士.研究方向：大氣污染與微生態(tài).E-mail：xiaochunling@symc.edu.cn