新疆野生羊肚菌物種多樣性研究

武冬梅，許文濤，謝宗銘，李全勝，祝建波，沈海濤，羅云波，*（.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京00083；3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京00083；.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆野生羊肚菌物種多樣性研究

武冬梅1，2，許文濤2，3，謝宗銘1，李全勝1，祝建波4，沈海濤4，羅云波2，3，*
（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京100083；4.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子832000）

根據(jù)子實(shí)體形態(tài)特征并結(jié)合rDNA ITS（Internal Transcribed Spacer）序列分析技術(shù)分析了根據(jù)形態(tài)特征挑選的、采自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰五地區(qū)的31株野生羊肚菌子實(shí)體。rDNA ITS序列分析表明，采自新疆兵團(tuán)185團(tuán)且形態(tài)學(xué)分類為半開羊肚菌（Morchella semilibera）的2株菌株實(shí)為羊肚菌科常見屬鐘菌屬的皺蓋鐘菌（Verpa bohemica）。以2株皺蓋鐘菌作為外類群，29株樣品與來自GenBank的羊肚菌屬各物種進(jìn)行ITS序列聚類，可以分為四大聚類群，其中25株菌株與Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26聚為第I類群；半開羊肚菌單獨(dú)聚為第II類群；1株菌株與Morchella frustrata聚為第III類群；3株菌株與Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7、Morchella sp.Mes-17共同聚為第四類群。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步認(rèn)為，上述五地區(qū)羊肚菌屬至少由7個(gè)物種構(gòu)成。根據(jù)國內(nèi)最新研究資料，其中2種為中國新紀(jì)錄種，分別為Morchella sp.Mes-17和Morchella frustrata（中立羊肚菌）。

新疆，野生羊肚菌，物種多樣性，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）

羊肚菌屬，隸屬子囊菌門，盤菌綱，盤菌目，羊肚菌科［1］，該屬模式種是羊肚菌［2］。因其典型特征為具有蜂窩狀或羊肚狀的菌蓋，故名羊肚菌。羊肚菌子實(shí)體肉質(zhì)脆嫩，味道鮮美，是一種世界公認(rèn)的珍稀、野生食藥用真菌［3-4］。

新疆特殊的地理環(huán)境孕育了豐富的野生羊肚菌資源，趙震宇［5］記載新疆常見的羊肚菌有5種，分別是黑脈羊肚菌、圓錐羊肚菌、羊肚菌、小羊肚菌、皺柄羊肚菌；卯曉嵐［6］記載新疆的5種羊肚菌分別是黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、羊肚菌、粗腿羊肚菌、高羊肚菌；已有相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道，新疆野生羊肚菌有小頂羊肚菌、高羊肚菌、小羊肚菌、尖頂羊肚菌、粗柄羊肚菌、黑脈羊肚菌、羊肚菌、離柄羊肚菌等［7-10］。

傳統(tǒng)的羊肚菌屬物種分類主要依據(jù)子實(shí)體的外觀形狀、菌絲、子囊、子囊孢子及側(cè)絲的形態(tài)特征［11-12］，如，根據(jù)菌蓋的形狀和顏色，菌蓋與菌柄是否分離，菌蓋表面棱紋的排列和顏色深淺，菌物學(xué)家將羊肚菌屬分為3大類，即黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類［13-14］。在上述三個(gè)廣義物種類群的基礎(chǔ)上，根據(jù)成熟子囊果的子實(shí)體和菌柄是否變紅提出了第4個(gè)類群，即變紅羊肚菌類群，包括產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶的3個(gè)種［2］。

有關(guān)新疆野生羊肚菌屬的物種構(gòu)成，無論5種，還是7種的分類記述，都是基于這種形態(tài)學(xué)分類界定的形態(tài)學(xué)物種。但因野生羊肚菌發(fā)育過程中具有形態(tài)特征隨環(huán)境條件和個(gè)體發(fā)育年齡發(fā)生一定變化的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，導(dǎo)致形態(tài)學(xué)分類具有不確定性，很容易導(dǎo)致出現(xiàn)同菌異名及同名異菌現(xiàn)象。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展帶領(lǐng)了真菌分類和系統(tǒng)發(fā)育研究的革命性變革［15-16］，DNA序列分析，特別是ITS序列分析技術(shù)，因其能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間及菌株直接的堿基對(duì)差異，已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的分類研究［17-25］。新疆的科研工作者也開展了基于ITS序列的野生羊肚菌分類研究，如蘇俊等［26］對(duì)新疆伊犁霍城縣大西溝采集的兩種形態(tài)不同的野生羊肚菌進(jìn)行分子水平的分類學(xué)鑒定，結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果不一致；劉偉等［27］的研究結(jié)果也表明，兩地區(qū)羊肚菌形態(tài)學(xué)上的差異是由于環(huán)境或發(fā)育不同階段的差異造成的；馮麗等［28］利用ITS序列分析技術(shù)確定采自新疆哈密松樹塘的野生羊肚菌為肋脈羊肚菌。

上述這種分子水平的研究對(duì)確定新疆不同地區(qū)羊肚菌種類并正確認(rèn)識(shí)和利用野生羊肚菌具有重要的理論意義。本研究以2011～2013年間自新疆野生羊肚菌主產(chǎn)區(qū)伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區(qū)采集到的部分野生羊肚菌為材料，提取子實(shí)體基因組DNA進(jìn)行ITS序列比對(duì)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)一步探討新疆野生羊肚菌的物種多樣性，旨在較為準(zhǔn)確地確定各地區(qū)分布的物種，進(jìn)而為野生羊肚菌人工栽培及進(jìn)一步的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生羊肚菌子實(shí)體分別于2011～2013年采自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區(qū)，共197份樣品，分別命名為M1～M197，根據(jù)Bunyard［29］的分類方法，按照子實(shí)體形態(tài)差異、色澤等特征將樣品分為3個(gè)大類群，黑色羊肚菌（黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、高羊肚菌）、半開羊肚菌、黃色羊肚菌（羊肚菌、粗柄羊肚菌）。按照不同地區(qū)及形態(tài)特征的典型性分別從中選取2～3份樣品作為ITS序列分析樣品，共計(jì)31份，樣品編號(hào)、來源、形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果見表1； 2×Easy Taq Mix、液氮、2×CTAB DNA提取液、裂解液北京康為世紀(jì)生物公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、蛋白酶K溶液（20mg/mL）、β-巰基乙醇（100mg/mL）、RNA酶（10mg/mL） 上海生工生物工程有限公司。

MM400組織破碎儀德國萊弛，用于樣品的破碎；DK-S24水浴鍋上海精宏；德國IKA渦旋振蕩器MS1 minishaker，用于樣品的混勻；Z-16KC冷凍離心機(jī)德國Sigma，用于DNA提取時(shí)冷凍離心；PCR儀Bio-Rad，Thermal cycle，用于DNA擴(kuò)增；T2A電泳儀凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad，用于電泳凝膠圖像的分析。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1野生羊肚菌子實(shí)體基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CTAB法提取野生羊肚菌子實(shí)體基因組DNA：分別稱取0.12～0.15g野生羊肚菌子實(shí)體樣品于2.0mL離心管中，于液氮中冷凍2min，置于組織破碎儀中研磨45s至粉末狀；迅速加入1000μL 2×CTAB DNA提取緩沖液、β-巰基乙醇20μL，蛋白酶K10μL，渦旋混勻，冰浴保存10min后4℃，12000r/min離心10min；棄上清，沉淀中加2×CTAB DNA裂解液（65℃預(yù)熱）500μL，β-巰基乙醇20μL，蛋白酶K10μL，混勻后置65℃水浴抽提30min，每10min翻轉(zhuǎn)一次，以保證充分裂解；冷卻，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，12000r/min離心10min；取上清，冷卻，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，12000r/min離心10min；取上清，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，靜置10min，12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用75%的乙醇洗滌兩次，10000r/min離心10min；棄上清，通風(fēng)干燥，40μL ddH2O溶解DNA，加入3μL RNA酶，37℃水浴消化30min后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以ddH2O將獲得的DNA稀釋10倍備用。

1.2.2ITS區(qū)擴(kuò)增及克隆測(cè)序采用White［21］設(shè)計(jì)的真菌核糖體基因間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1/ITS4分別對(duì)31株供試材料rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μL）為：2×Easy Taq Mix 10μL，ITS1（10μmol/L）0.8μL，ITS4（10μmol/L）0.8μL，模板DNA 0.6μL，ddH2O 7.8μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，57℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，31個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min結(jié)束反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別用DNA凝膠回收試劑盒分別回收純化目的片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院肖寧的《學(xué)前教育專業(yè)校企合作共建機(jī)制的探索與實(shí)踐》一文中提出“共建人才培養(yǎng)方案、共建實(shí)踐教學(xué)基地、共建課程、共建課堂”四建的全新觀點(diǎn)。在這當(dāng)中校企、校園要共同參與人才培養(yǎng)的測(cè)評(píng)及教學(xué)管理的工作，共同制定考核標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定相似的教學(xué)環(huán)境與工作環(huán)境，統(tǒng)一教學(xué)內(nèi)容和工作任務(wù)，了解教師與崗位工作者的要求，切實(shí)落實(shí)完善“校企共育，全程實(shí)踐”的人才培養(yǎng)模式。

1.2.3序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建31株供試材料測(cè)序后分別利用DNAStar Lasergene.v 7.1軟件包中的Editseq進(jìn)行處理，得到ITS片段全序列（18s+ITS1+ 5.8S+ITS2+28s）信息。將獲得的ITS全序列剔除兩端的載體序列、引物序列及18S、28S序列，使序列信息盡可能一致。利用上述軟件計(jì)算各序列間的相似性、序列趨異度，MEGA 5.0軟件計(jì)算樣品遺傳距離。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較。

表1　材料及來源Table 1　Materials and source

鑒于相關(guān)的研究報(bào)道［30］，Genbank內(nèi)至少有66%的羊肚菌ITS序列的物種名稱是錯(cuò)誤的，同物異名和異物同名的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，不能以GenBank中的ITS序列作為判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究所用比對(duì)分析序列全部為杜習(xí)慧等［30］提交的正確序列。用MEGA 5.0中的Alignment程序?qū)λ鶞y(cè)得的ITS序列進(jìn)行多重對(duì)位排列，并手動(dòng)刪除對(duì)位排列結(jié)果中的非對(duì)位排列序列。對(duì)位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作pair-wise處理，分析時(shí)所用參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)值。以采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)十師185團(tuán)的皺蓋鐘菌XJT2、XJT4分別作為構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)外類群菌株，采用鄰位相連法［31］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法（Bootstrap，1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的置信度［32］。

2　結(jié)果與分析

2.1野生羊肚菌子實(shí)體基因組DNA提取及ITS序列PCR擴(kuò)增測(cè)序

由于野生羊肚菌中多糖、膠質(zhì)等次生代謝物含量較高，容易與DNA吸附，給基因組DNA的提取和純化帶來一定困難。研究中采用改進(jìn)的CTAB法，電泳結(jié)果顯示該法可以順利提取出羊肚菌子實(shí)體基因組DNA（圖1、圖2）。

分別以31株供試樣品基因組DNA為模板，采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，均得到清晰的、與預(yù)期大小一致的特異性條帶。其中，有25個(gè)樣品的ITS序列在750bp左右，1個(gè)樣品的ITS序列在1000bp左右，3個(gè)樣品的ITS序列在1200bp左右，2個(gè)樣品的ITS序列在800bp左右（圖3～圖4）。該結(jié)果與Wipf等［13］的研究結(jié)果一致，即黑色羊肚菌的ITS序列長(zhǎng)度在740～750bp之間；黃色羊肚菌的ITS序列在1150～1220bp之間。

圖1　野生羊肚菌基因組DNAFig.1　Wild Morchella genome DNA

圖2　野生羊肚菌基因組DNAFig.2　Wild Morchella genome DNA

圖3　基因組DNA ITS序列擴(kuò)增Fig.3　Amplification of ITS from genome

圖4　基因組DNA ITS序列擴(kuò)增Fig.4　Amplification of ITS from genome

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化后連接至pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定，均得到與預(yù)期大小一致的特異性目的片段。結(jié)果表明，已分別克隆了31份樣品ITS序列。所得轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序后均全部獲得ITS區(qū)全序列信息。

2.2ITS序列分析

31份樣品中，種內(nèi)趨異度較小，為0.1～0.3；種間趨異度較大，如M1和M194序列趨異度達(dá)66.8。M1、M24、M62、M194、XJT2、XJT4 6份樣品的序列相似率為56.1%～70.5%，其余樣品序列相似率在97.1%～100.0%之間。31份樣品的遺傳距離為0.0000～0.5067，其中26份遺傳距離為0.0000～0.0255；XJT2、XJT4為鐘菌屬，與其他材料遺傳距離較大，為0.5067；M1、M24和M62、M194與其他材料的最大遺傳距離分別為0.3507、0.3353、0.3166。遺傳距離參數(shù)能夠反映種間的親緣關(guān)系。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果顯示，31份供試材料中，M10、M12、M25、M30等16份材料ITS序列與數(shù)據(jù)庫中收錄的Morchella sp.Mel-17/19/20/34序列相似率達(dá)99%～100%；M15、M72、M111、M151等7份材料ITS序列與Morchella sp. Mel-23/24/31/32序列相似率達(dá)99%；M188、M106與Morchella sp.Mel-13/26序列相似率達(dá)99%～100%；M24、M62與Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7序列相似率99%；M194與Morchella frustrata（中立羊肚菌）序列相似率達(dá)99%；M1與Morchella sp.Mes-17序列相似率達(dá)99%；XJT2、XJT4則與Verpa bohemica（皺蓋鐘菌）序列相似率達(dá)99%。

2.3基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分析

31份供試材料ITS序列、自NCBI數(shù)據(jù)庫下載的同源性較高的序列及實(shí)驗(yàn)材料中沒有涉及的羊肚菌屬其他物種ITS序列，以皺蓋鐘菌Verpa bohemica作為外類群，采用鄰位相連法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所顯示的進(jìn)化樹如圖5所示。

從圖5系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，以采集的皺蓋鐘菌為外類群，其余29份樣品與下載自NCBI數(shù)據(jù)庫中的尖頂羊肚菌、粗柄羊肚菌、半開羊肚菌、羊肚菌進(jìn)行聚類，可以分為四大聚類群。M25、M30等25份樣品序列差異較小，親緣關(guān)系較近，與來自數(shù)據(jù)庫的Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/ 24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26所代表的不同物種，以99%的Bootstrap值共同聚在第I類群；半開羊肚菌單獨(dú)聚為第II類群；樣品M194以99%的Bootstrap值與Morchella frustrata聚為第III類群；來自NCBI的羊肚菌，粗柄羊肚菌，海綿羊肚菌、Morchella sp.Mes-17與供試樣品M1、M24、M62共同聚類在第IV類群，但樣品M1與Mes-17親緣關(guān)系近，M24、M62則與Morchella sp.Mes-6親緣關(guān)系更近。

3　結(jié)論

綜合利用形態(tài)學(xué)分類方法、rDNA ITS序列分析技術(shù)分析確定采集自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區(qū)的野生羊肚菌的歸屬，探討新疆野生羊肚菌物種多樣性，為新疆野生羊肚菌保護(hù)及開發(fā)利用提供幫助。

圖5　基于ITS序列構(gòu)建的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic trees based on rDNA ITS sequence

根據(jù)分析結(jié)果初步判定上述五地區(qū)的野生羊肚菌由黑色羊肚菌和黃色羊肚菌兩大類群構(gòu)成，黑色羊肚菌物種構(gòu)成為Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/ 26、Morchella frustrata（中立羊肚菌）；黃色羊肚菌物種構(gòu)成為Morchella sp.Mes-17、Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7。研究顯示，迄今為止，羊肚菌屬系統(tǒng)發(fā)育種中只有20個(gè)系統(tǒng)發(fā)育種有各自的獨(dú)特形態(tài)特征，可以用形態(tài)特征區(qū)分，并有相應(yīng)的中文名及拉丁名［2］，其他物種都有待進(jìn)一步研究和命名，因此，本研究根據(jù)rDNA ITS序列對(duì)新疆野生羊肚菌歸屬僅進(jìn)行了初步的分析，還不能界定到具體的物種并正確命名。但結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可以認(rèn)為，上述五地區(qū)至少分布有7種野生羊肚菌。且根據(jù)最新研究資料［33］，7個(gè)物種中，有5種在前人的研究中有過報(bào)道，Morchella frustrata（中立羊肚菌）及Morchella sp.Mes-17在中國尚未有報(bào)道，初步判定為新種，正在做進(jìn)一步的鑒定。

另外，31份樣品中，采集自新疆兵團(tuán)185團(tuán)的樣品，根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定為半開羊肚菌，分子鑒定結(jié)果顯示，該菌株實(shí)為羊肚菌科常見的鐘菌屬物種皺蓋鐘菌。

4　討論

野生羊肚菌發(fā)育過程中形態(tài)特征隨環(huán)境條件和個(gè)體發(fā)育年齡發(fā)生一定程度的變化，根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。目前主要采用ITS序列分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。

盡管目前ITS序列分析技術(shù)已經(jīng)成為真菌界廣泛應(yīng)用的一個(gè)分子標(biāo)記，已經(jīng)成功應(yīng)用于對(duì)松茸、松乳菇等珍稀食用菌純培養(yǎng)菌種的鑒定［34-36］，為菌種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析提供了重要依據(jù)。但是，近年來，對(duì)于Genbank中序列的可靠性，部分學(xué)者持懷疑態(tài)度，認(rèn)為至少有66%的羊肚菌ITS序列的物種名稱是錯(cuò)誤的，同物異名和異物同名的現(xiàn)象非常嚴(yán)重［33，37-41］。本研究中進(jìn)行同源序列聚類時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在聚類混亂現(xiàn)象，因此，僅僅依靠ITS序列的序列分析就略顯不夠嚴(yán)謹(jǐn)。

鑒于以上原因，在運(yùn)用ITS序列分析技術(shù)的同時(shí)，如果再輔以RPB1、RPB2、EF1a等基因片段，可能會(huì)更準(zhǔn)確、全面。因此，本研究將在物種多樣性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合RPB1、RPB2、EF1a等基因片段做進(jìn)一步的分析，以使結(jié)果更加完善，這不僅可以豐富新疆野生羊肚菌多樣性的菌種資源庫信息，還可以為野生羊肚菌的人工栽培及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。新疆地大物博，物種多樣性豐富，羊肚菌屬的分類研究任重而道遠(yuǎn)。

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Study on species diversity of wild Morchella in Xinjiang

WU Dong-mei1，2，XU Wen-tao2，3，XIE Zong-ming1，LI Quan-sheng1，ZHU Jian-bo4，SHEN Hai-tao4，LUO Yun-bo2，3，*
（1.Biotechnology Research Institue，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences/Xinjiang Production& Construction Group Key Laboratory of Crop Germplasm Enhancement and Gene Resources Utilization，Shihezi 832000，China；2.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.TheSupervision，Inspection&TestingCenterofGeneticallyModifiedFoodSafety，MinistryofAgriculture，Beijing100083，China；4.College of Life Sciences of Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Thirty-one wild Morchella specimens，which were collected from five different areas in Xinjiang and selected on the basis differences in fruit body morphology，then they were identified by morphological characteristics and internal transcribed spacer sequence analysis respectively.The results showed that two strains belonged to Verpa bohemica，not Morchella semilibera，which collected from 185 regiment in Xinjiang. When the two Verpa bohemica strains were taken as outgroup，phylogenetic trees were produced by the ITS sequences of the twenty-nine strains and other species of Morchella from GenBank.Phylogenetic analysis indicated that the twenty-five strains and Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26 formed the first cluster.Morchella semilibera belonged to the second cluster.One strains and Morchella frustrata formed the third cluster.The fourth cluster included three strains and Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7 and Morchella sp.Mes-17.Morphological characteristics and phylogenetic analysis indicated that there were at least seven species of Morchella in these five area of Xinjiang.According to recent research，Morchella sp.Mes-17 and Morchella frustrate were two new species of Morchella in China. Key words：Xinjiang；wild Morchella；species diversity；internal transcribed spacer sequence

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.027

2014－05－06

武冬梅（1976-），女，碩士研究生，副研究員，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)及生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究。

羅云波（1960-），男，博士，教授，主要從事食品安全、食品生物技術(shù)、果蔬貯藏保鮮方面的研究。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31160011）；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA.891001）；石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2012ZRKXYQ-YD15）。