反相-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食品中4種α-二羰基化合物

吳泰鋼，黃才歡，白衛(wèi)濱，邱瑞霞，劉　柳，張振華，歐仕益

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

反相-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食品中4種α-二羰基化合物

吳泰鋼，黃才歡，白衛(wèi)濱，邱瑞霞，劉柳，張振華，歐仕益*

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

建立了4種α-二羰基化合物［3-脫氧奧蘇糖（3-DG）、乙二醛（GO）、丙酮醛（MGO）、2，3-丁二酮（2，3-BD）］的反相-高效液相色譜檢測(cè)方法。首先將α-二羰基化合物與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹喔啉衍生物（溫度為60℃，pH=9.00，反應(yīng)時(shí)間4h），然后用HPLC檢測(cè)。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6mm×250mm，5μm），流速為0.7mL/min，流動(dòng)相A為0.1%醋酸水溶液，B為甲醇，線性梯度洗脫程序?yàn)椋?～35min，B 35%～70%；35～40min，B 70%～35%；40～50min，B 35%。30min內(nèi)4種喹喔啉衍生物得到了較好的分離。方法學(xué)考察結(jié)果表明該HPLC方法具有很好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，能夠滿足定量分析的要求。同時(shí)該方法適用于蜂蜜、食醋、涼果、咖啡中4種α-二羰基化合物含量的檢測(cè)。

反相-高效液相色譜，α-二羰基化合物，鄰苯二胺，測(cè)定

α-二羰基化合物（3-DG、GO、MGO、2，3-BD）是糖類(lèi)通過(guò)焦糖化反應(yīng)逆醛醇縮合和自動(dòng)氧化［1］及Maillard反應(yīng)過(guò)程中Amadori化合物降解形成的活潑中間產(chǎn)物［2］，廣泛存在于蜂蜜、啤酒、甜酒、咖啡、食用油、醋［1］、酸奶、醬油［3］中，是食品中風(fēng)味和色澤物質(zhì)的重要前體［4］。但攝入后會(huì)影響人體健康，如3-DG、GO、MGO會(huì)使蛋白質(zhì)糖基化，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成糖化終末產(chǎn)物（AGEs）［5］，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，促使炎癥的發(fā)生［6］。細(xì)胞中MGO和GO的濃度為1～2μmol/L，半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為300μmol/L～1mmol/L［7］。2，3-BD容易導(dǎo)致人體患上乳糖不耐癥以及腸道易激綜合癥［8］。因此，在常見(jiàn)加工食品中，探索準(zhǔn)確、靈敏的α-二羰基化合物含量的檢測(cè)方法，對(duì)于正確評(píng)價(jià)加工食品品質(zhì)及安全性具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

α-二羰基化合物活性高、穩(wěn)定性低，一般只能檢測(cè)到天然能穩(wěn)定存在的α-二羰基化合物或者經(jīng)過(guò)還原反應(yīng)后產(chǎn)生的醇類(lèi)物質(zhì)，因此難以滿足對(duì)食品反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的所有α-二羰基化合物的定性及定量分析。目前，鑒定α-二羰基化合物的前處理方法通常是采用捕獲劑法，即使用與α-二羰基化合物反應(yīng)活性高的試劑，如巰基乙胺、氨基胍、甲基羥胺、Girard T試劑、鄰苯二胺與α-二羰基化合物分別生成噻唑烷、3-氨基-1，2，4-三嗪衍生物、肟、脎、喹喔啉衍生物［2］。在所有的捕獲劑中，鄰苯二胺因?yàn)榉磻?yīng)活性高，引起測(cè)量誤差小，出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率低，因此是比較合適及常用的捕獲劑［9］。

國(guó)內(nèi)有報(bào)道關(guān)于二羰基化合物與糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)系［10］，然而對(duì)于普通食品中這類(lèi)化合物的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)外Ferreira，Daglia，Weigel［11-13］均采用鄰苯二胺與α-二羰基化合物發(fā)生衍生反應(yīng)從而檢測(cè)它們?cè)谄胀ㄊ称分械暮?。然而兩者的反?yīng)pH、時(shí)間、溫度各異。因此本研究首先探討了3-DG與鄰苯二胺的最佳反應(yīng)pH和時(shí)間，然后建立4種α-二羰基化合物的反相-高效液相色譜檢測(cè)方法，并將此方法應(yīng)用于蜂蜜、醋、涼果、咖啡中α-二羰基化合物含量的檢測(cè)。期望公眾對(duì)于食品中α-二羰基化合物的安全性引起高度的重視并為其含量的檢測(cè)提供有效的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

3-DG（4084-27-9）、GO（107-22-2）、MGO（78-98-8）、2，3-BD（431-03-8）百靈威公司；鄰苯二胺廣州化學(xué)試劑公司；蜂蜜、咖啡、涼果、醋暨南大學(xué)興安超市；甲醇（色譜純）美國(guó)Mallinckrodt Baker公司；液相用水華潤(rùn)怡寶食品飲料（深圳）有限公司；0.45μm微孔濾膜天津津騰實(shí)驗(yàn)有限公司。

pH計(jì)、UV-9600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京瑞利分析儀器公司；粉碎機(jī)廣州大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州英峪予華儀器有限公司；FM烘箱上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHA-BA恒溫振蕩儀常州市偉嘉儀器制造有限公司；KDC-12低速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；LC-20AT高效液相色譜儀配備SPD-M 20A光電二極陣列檢測(cè)器（PAD）和Lc-solution色譜工作站，日本島津公司。

1.2喹喔啉衍生物生成的最佳條件

α-二羰基化合物因帶雙羰基結(jié)構(gòu)具有高度的活性，4種α-二羰基化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹喔啉衍生物，反應(yīng)過(guò)程如圖2所示，屬于羰胺反應(yīng)，受pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響。

圖1　4種α-二羰基化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structural formular of 4α-dicarbonyls

圖2　α-二羰基化合物與鄰苯二胺的反應(yīng)過(guò)程［14］Fig.2　Derivatization reaction ofα-dicarbonyls with phenylenediamine［14］

3-DG是典型的α-二羰基化合物，因此，本研究用3-DG與鄰苯二胺反應(yīng)，探究喹喔啉衍生物生成的最佳pH和反應(yīng)時(shí)間。

1.2.1喹喔啉衍生物生成的最佳pH向6支10.00m L試管中分別加入1m L 100μg/m L的3-DG溶液、1m L 1mg/m L鄰苯二胺溶液，然后用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液將其pH分別調(diào)為1.60、2.90、3.70、6.80、9.00、10.00，最后用相應(yīng)pH溶液定容至5.00m L。在60℃烘箱中反應(yīng)1h，取樣測(cè)量喹喔啉衍生物含量。

1.2.2喹喔啉衍生物生成的最佳反應(yīng)時(shí)間向25.00m L試管中加入5.00m L 100μg/m L的3-DG溶液，5.00m L 1mg/m L鄰苯二胺溶液，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)為9.00，最后用相應(yīng)pH溶液定容25.00m L，在60℃烘箱中反應(yīng)1、2、3、4、5h，分別取樣測(cè)量喹喔啉衍生物含量。

1.3樣品液制備

1.3.1食醋樣品測(cè)定取10.00m L醋，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)為9.00，向其中加入0.10g鄰苯二胺，用渦旋振蕩器將其振蕩均勻。然后將其置于恒溫振蕩器中反應(yīng)4h（82r/min，溫度60℃）。反應(yīng)結(jié)束后，將樣液在3500r/m in下離心5m in，取上清液用HPLC測(cè)定。

1.3.2蜂蜜樣品測(cè)定取10.00m L蜂蜜，將其稀釋6倍，其他操作和醋一樣，取其上清液進(jìn)行HPLC測(cè)量。

1.3.3涼果樣品測(cè)定取涼果的果實(shí)將其放在105℃烘箱中烘干4h至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，稱(chēng)10g粉末，加入100.00m L蒸餾水后，其他操作和醋一樣，取其上清液進(jìn)行HPLC測(cè)量。

1.3.4咖啡樣品測(cè)定稱(chēng)10.00g咖啡粉末［12］，加入100.00m L蒸餾水后，其他操作和醋一樣，取其上清液進(jìn)行HPLC測(cè)量。

1.4HPLC分析方法

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6mm×250mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)314nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL，流速為0.7m L/m in，流動(dòng)相A為0.1%醋酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫：0～35min，B 35%～70%；35～40min，B 70%～35%；40～50m in，B 35%。

1.5回收率以及儀器檢出限和定量限的測(cè)定

回收率：向已知濃度的樣品溶液中加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為20μg/m L，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各物質(zhì)含量。回收率（%）=100×（2×測(cè)定濃度-初始濃度）/加樣濃度；儀器檢出限（LOD）、定量限（LOQ）分別定義為3倍和10倍空白樣品信號(hào)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度。

1.6數(shù)據(jù)處理方法

使用Excel處理數(shù)據(jù)，ChemDraw畫(huà)化學(xué)式。所有定量結(jié)果測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與分析

2.1喹喔啉衍生物生成的最佳pH

由圖3可知，當(dāng)pH=9.00時(shí)，3-DG與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹喔琳衍生物的量最多。原因可能是在堿性環(huán)境下，鄰苯二胺氨基去質(zhì)子化，易于與3-DG發(fā)生反應(yīng)，而pH太高則可能造成鄰苯二胺脫氨［15］。

圖3　pH對(duì)喹喔啉衍生物生成量的影響Fig.3　Effect of pH on the yield of quinoxaline derivative

2.2喹喔啉衍生物生成的最佳反應(yīng)時(shí)間

由圖4可知，3-DG與鄰苯二胺反應(yīng)前3h，喹喔啉衍生物生成量呈下降趨勢(shì)，可能是前3h喹喔啉衍生物的消解大于生成。反應(yīng)4h時(shí)，喹喔啉衍生物生成量最多。5h時(shí)，又呈下降趨勢(shì)。因此，在60℃，pH=9.00條件下，3-DG與鄰苯二胺最佳反應(yīng)時(shí)間為4h。

圖4　反應(yīng)時(shí)間對(duì)喹喔啉衍生物生成量的影響Fig.4　Effect of time on the yield of quinoxaline derivative

2.3最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的確定與分析

分別通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器掃描得到4種α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品與鄰苯二胺反應(yīng)生成的喹喔啉衍生物紫外光譜圖。掃描結(jié)果如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)喹喔啉衍生物在190、230、314nm都出現(xiàn)吸收峰。然而，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為190和230nm時(shí)溶劑與其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)干擾很大，因此最終檢測(cè)波長(zhǎng)確定為314nm。

2.4分離條件優(yōu)化

在Arena［16］的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，開(kāi)始使用純水和甲醇作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)3-DG所對(duì)應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾。向水中加入0.1%醋酸后，發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象明顯減小?？赡芤?yàn)?-DG屬于多羥基化合物，在溶液中以離子態(tài)的形式存在，呈弱酸性，加醋酸抑制3-DG電離，從而改善其峰形。

采用流動(dòng)相為甲醇和0.1%的醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇濃度在70m in之內(nèi)從20%升高到36%，四種標(biāo)準(zhǔn)品分離度很差。當(dāng)甲醇濃度在70min之內(nèi)從30%升高到70%，4種標(biāo)準(zhǔn)品分離效果很好，但分離時(shí)間較長(zhǎng)。將甲醇初始濃度調(diào)整為35%后，4種標(biāo)準(zhǔn)品不僅分離度很好，而且出峰時(shí)間明顯縮短，30m in內(nèi)4種標(biāo)準(zhǔn)品得到很好分離（圖6），3-DG、GO、MGO、2，3-BD的保留時(shí)間分別為9.436、19.54、23.24、26.40m in。

圖5　喹喔啉衍生物紫外光譜圖Fig.5　Ultraviolet spectra of quinoxaline derivative

2.5定量分析方法學(xué)考察［17］

建立了3-DG、GO、MGO、2，3-BD定量分析方法，方法學(xué)考察結(jié)果見(jiàn)表1。在線性范圍內(nèi)，均勻取6個(gè)濃度，測(cè)定其峰面積，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。各化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.994。方法精密度：連續(xù)測(cè)定濃度為20μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)品3次，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表1可知，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.16%～0.65%之間，面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于2.28%～4.42%之間，表明方法穩(wěn)定性很好。

圖6　α-DCC標(biāo)準(zhǔn)品（A）、醋與鄰苯二胺反應(yīng)生成的喹喔啉衍生物（B）色譜圖Fig.6　The HPLC chromatography of quinoxaline derivative：standard（A）and sample（B）

測(cè)試結(jié)果顯示：五種化合物的加標(biāo)回收率介于97.3%～109.3%之間。4種化合物的儀器檢出限（LOD）為0.01～0.42μg，定量限（LOQ）為0.04～0.89μg。方法學(xué)考察結(jié)果表明本HPLC方法具有良好的準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度，可用于實(shí)際樣品的分析。

2.6樣品分析

將建立的定量分析方法用于4種食品中α-二羰基化合物的定量分析，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。不同食品中α-二羰基化合物含量差異較大，4種食品中均檢測(cè)到GO、MGO。3-DG在蜂蜜、涼果中含量遠(yuǎn)高于醋。醋中2，3-BD的含量是涼果的8.53倍?？Х戎?-DG、2，3-BD和蜂蜜中2，3-BD含量均低于檢測(cè)限。

3　結(jié)論

在溫度為60℃的條件下，3-DG與鄰苯二胺衍生反應(yīng)的最佳條件是pH=9.00，反應(yīng)時(shí)間4h；色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.6mm×250mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)314nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL，流速為0.7m L/m in，流動(dòng)相A為0.1%醋酸水溶液，B為甲醇，線性梯度洗脫程序?yàn)椋?～35min，B 35%～70%；35～40min，B 70%～35%；40～50m in，B 35%。30m in內(nèi)4種喹喔啉衍生物得到了較好的分離。方法學(xué)考察結(jié)果表明該HPLC方法具有很好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性；3-DG在蜂蜜、涼果中含量遠(yuǎn)高于醋。醋中2，3-BD的含量是涼果的8.53倍?？Х戎?-DG、2，3-BD和蜂蜜中2，3-BD含量均低于檢測(cè)限。

表1　檢測(cè)方法線性、精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　Precision，linearity and recovery of HPLCmethod of different analyzes

表2　4種食品中α-二羰基化合物含量Table 2　Contents ofα-dicarbonyls in four kinds of food

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Simultaneous determ ination of fourα-dicarbonyls in food by RP-HPLC-DAD

WU Tai-gang，HUANG Cai-huan，BAIWei-bin，QIU Rui-xia，LIU Liu，ZHANG Zhen-hua，OU Shi-yi*
（Departmentof Food Science and Engineering，Ji’nan University，Guangzhou 510632，China）

ARP-HPLCquantitative methodfor simultaneous determ ination of fourα-dicarbonyls，3-deoxyg lucosulose（3-DG），g lyoxal（GO），methylg lyoxal（MGO），and 2，3-butaned ione（2，3-BD），was estab lished.α-d icarbonyls were reacted w ith phenylenediam ine to form quinoxaline derivative at 60℃，pH9.00 for 4h.The derivatives were separated on an Agilent column ZORBAX SB-Aq（4.6mm×250mm，5μm）using 0.1%acetic acid aqueous solution（A）and methanol（B）as mobile phase for the follow ing stepw ise grad ient elution：35%～70%（B）in 0～35m in，70%～35%（B）in 35～40m in，35%（B）in 40～50m in，the flow rate was 0.7m L/m in.The results showed that the four quinoxaline derivatives were well separated w ithin 30m in.This method could meet the quantitative analysis because of its good rep roducibility and accuracy confirmed by methodology.It was also well app lied in the determ ination of fourα-dicarbonyls in honey，vinegar，p reserved fruit，and coffee.

RP-HPLC；α-d icarbonyls；phenylened iam ine；determ ination

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.003

2014-06-19

吳泰鋼（1990-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

歐仕益（1963-），男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31371745）；科技部863項(xiàng)目（2012BAK01B03）。