兩種方法定量檢測(cè)HBV異常血清標(biāo)志物與血清HBV DNA水平的關(guān)系

黃粱鑌　張雄　龍欣　趙曉玲 　田應(yīng)敏

兩種方法定量檢測(cè)HBV異常血清標(biāo)志物與血清HBV DNA水平的關(guān)系

黃粱鑌張雄★龍欣趙曉玲 田應(yīng)敏

目的 對(duì)經(jīng)確認(rèn)的血清乙肝表面抗原（HBsAg）高值患者，測(cè)定其血清乙型肝炎病毒（HBV）-DNA結(jié)果，探討兩者間的關(guān)系，為個(gè)體化診療提供更好的依據(jù)。方法 2013年共用時(shí)間分辨熒光免疫（TRFIA）法初步檢查HBV-M標(biāo)本9140例，陽(yáng)性數(shù)值較高的患者175例，再采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫法（MEIA）進(jìn)行定量復(fù)檢及運(yùn)用FQ-PCR進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)。 統(tǒng)計(jì)2次定量結(jié)果及HBV-DNA檢測(cè)含量分布并與HBsAg含量比對(duì)分析。結(jié)果 運(yùn)用TRFIA法及MEIA法檢測(cè)結(jié)果之間差異不明顯，定量分析結(jié)果與HBV-DNA之間，HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例為58.8%，3.0～4.0比例為17.6%，＜3.0為17.6%。HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例為19.4%，3.0～4.0比例為6.9%，＜3.0為73.6%。HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例為27.2%，3.0～4.0比例為5.7%，＜3.0為67.1%。結(jié)論 定量方法檢測(cè)HBsAg，是對(duì)FQ-PCR法的有益補(bǔ)充，與FQ-PCR法測(cè)定HBV- DNA含量相結(jié)合，能更全面地掌握患者乙肝病毒復(fù)制程度及病毒蛋白合成水平，能為個(gè)體化治療提供更加科學(xué)可靠的依據(jù)。

中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)于2012年對(duì)《慢性乙型肝炎防治指南》進(jìn)行更新［1］。以規(guī)范慢性乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）的預(yù)防、診斷和治療。乙肝診治時(shí)最重要的指標(biāo)是血清學(xué)標(biāo)志物與HBVDNA，HBV血清學(xué)檢測(cè)可用定量的方法進(jìn)行，另外HBV DNA定量檢測(cè)可反映病毒復(fù)制水平。本資料對(duì)本院2013年以來，通過HBV-M定量檢測(cè)后結(jié)果異常的標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，同時(shí)對(duì)HBV-DNA檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2013年1月至12月本院門診和感染科患者初次定量檢測(cè)HBsAg 9140例，陽(yáng)性數(shù)值較高的患者175例，男85例，女90例；年齡9～83歲，平均43.7歲。當(dāng)天的HBV標(biāo)本定量檢測(cè)完成后，將血清標(biāo)本保存于-20°冰箱，再采用另外的方法進(jìn)行定量及HBV-DNA檢測(cè)。

1.2方法 （1）HBV血清學(xué)定量檢測(cè)：①HBV血清學(xué)常規(guī)定量檢測(cè)：方法為時(shí)間分辨免疫熒光分析法（TRFIA法），采用上海新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Anytest-2000型 時(shí)間分辨熒光分析儀及其配套試劑（HBsAg批號(hào)：8600010214-8600011791）。測(cè)定前用試劑盒內(nèi)配套乙型肝炎線性參比品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由Anytest 2003中文軟件得出其各標(biāo)準(zhǔn)曲線，皆符合工作要求。②HBV血清學(xué)復(fù)檢定量：采用微粒子化學(xué)發(fā)光法，采用美國(guó)ABBOTY（雅培）公司生產(chǎn)的Abbott ARCHITECT i2000SR 免疫分析儀及其配套試劑（HBsAg）。質(zhì)控品批號(hào)：31568LF00。（2）HBV-DNA定量分析：①儀器試劑：HBV-DNA核酸定量檢測(cè)試劑盒為廣州達(dá)安公司產(chǎn)品，臺(tái)式高速微量離心機(jī)，上海SLAN熒光定量PCR擴(kuò)增儀，生物安全柜等。②血HBV-DNA定量檢測(cè)：采用PCR熒光探針法檢測(cè)HBV DNA病毒水平；待測(cè)標(biāo)本和質(zhì)控標(biāo)本一起處理，質(zhì)控標(biāo)本包括陰性對(duì)照、低值質(zhì)控和高值質(zhì)控，質(zhì)控品由北京康徹期坦公司出品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；采用煮沸裂解法從100μl血清中提取HBV DNA，終體積為10μl；取上清液2μl為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增體系為2μl模板和38μl熒光PCR試劑。用SLAN FQ-PCR儀擴(kuò)增，條件為93℃ 2min；93℃ 45S，55℃ 60s 10個(gè)循環(huán)至 93℃30s，55℃ 45s 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，參照試劑盒說明書設(shè)定結(jié)果分析條件參數(shù)（閾值和基線）；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)標(biāo)本DNA濃度。試劑盒最低檢出限為1.0×102IU/mL。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1常規(guī)定量檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1　2013年TRFIA法檢測(cè)HBsAg結(jié)果含量分布（±s）

表1　2013年TRFIA法檢測(cè)HBsAg結(jié)果含量分布（±s）

注：0.2是廠家推薦的臨界陽(yáng)性值

HBsAg濃度分組（μg/ml）n各陽(yáng)性組HBsAg濃度（μg/ml）＜0.28963 0.2～1093.43±1.45 11～1002050.53±30.95＞100146209.95±33.3

2.2復(fù)檢定量檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2　2013年CLIA法對(duì)異常HBsAg復(fù)檢結(jié)果含量分布（±s）

表2　2013年CLIA法對(duì)異常HBsAg復(fù)檢結(jié)果含量分布（±s）

注：0.5是廠家推薦的臨界陽(yáng)性值

HBsAg濃度分組（IU/ml）n各組HBsAg濃度（IU/ml）0.05～1074.98±3.78 11～1001948.78±26.59＞100149219.84±22.49

2.3HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果 見表3。

表3　不同含量HBsAg定量結(jié)果與HBV-DNA水平構(gòu)成分析

3　討論

臨床上自2000年以來，逐漸開始使用粒子酶免分析法（MEIA）、化學(xué)或電化學(xué)發(fā)光法等檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物。MEIA因具有極高的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性等特點(diǎn)而得到肯定［2］。TRFIA是一種新的高靈敏的檢測(cè)方法。以其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光的干擾、標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便且穩(wěn)定、無放射性污染、多標(biāo)記等特點(diǎn)，近年來在醫(yī)院內(nèi)應(yīng)用較多。

乙型肝炎治療時(shí)，血清HBV DNA水平是目前臨床上評(píng)價(jià)HBV復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且對(duì)非活動(dòng)性HBsAg攜帶狀態(tài)的判定有重要意義。而HBV DNA水平則是對(duì)治療方案進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整的重要依據(jù)［3］，一旦開始治療，則應(yīng)每3～6個(gè)月檢測(cè)1次血清HBV-DNA水平，同時(shí)檢測(cè)ALT、HBeAg和HBeAb水平［4］。未提出同時(shí)檢測(cè)HBsAg，結(jié)合本資料結(jié)果，HBsAg＞100且eAg陽(yáng)性的標(biāo)本中，＜3.0占17.6%，eAb陽(yáng)性的標(biāo)本中，＜3.0占73.6%。分析原因如下：（1）乙肝的自然病程的四個(gè)分期中，表面抗原基本上不會(huì)消失，而每年約1%非活動(dòng)性HBsAg攜帶者可自發(fā)性清除HBsAg，臨床治療的目標(biāo)是發(fā)生eAg-eAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不到HBV-DNA［5］。（2）HBsAg含量與HBV- DNA含量間不平行，HBsAg濃度高的標(biāo)本，HBV-DNA并不一定高，可能與人群對(duì)乙肝病毒特異性免疫應(yīng)答水平存在極大的個(gè)體差異，不同的感染方式和年齡有不同的自然過程，機(jī)體對(duì)乙肝病毒的免疫應(yīng)答水平隨年齡、遺傳因素不同而差異較大，導(dǎo)致在免疫清除期時(shí)個(gè)體的HBsAg與HBV-DNA結(jié)果不平行。（3）在非活動(dòng)期時(shí)，多數(shù)患者發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，仍有低水平的HBV復(fù)制，表現(xiàn)為HBsAg陽(yáng)性，而HBV-DNA檢測(cè)不到或較低［6］。（4）使用抗病毒藥物或患者處在免疫清除階段時(shí)，血清中病毒抗原與HBV DNA水平的變化速度是不一致的，后者清除速度較快，而當(dāng)血清HBV DNA降至檢測(cè)水平以下時(shí)，肝內(nèi)仍可有HBV復(fù)制［7］。（5）操作方法的原因：盡管越來越多實(shí)驗(yàn)室通過衛(wèi)生部PCR實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，但是在方法學(xué)上多數(shù)實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到核酸標(biāo)本的自動(dòng)提取和純化水平，廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)品多數(shù)是核苷合成物，而非血清基質(zhì)，為保證曲線的相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)品不需要和標(biāo)本一樣的擴(kuò)增步驟。試劑本身達(dá)不到國(guó)際主流的適合自動(dòng)化操作的磁珠法要求，同時(shí)亦降低了結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度［4］。

綜上所述，作者認(rèn)為，TRIFA法測(cè)定乙肝病毒標(biāo)志物，是對(duì)FQ-PCR法的有益補(bǔ)充，有助于了解患者病毒抗原的合成與釋放水平，協(xié)助判斷患者肝細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制程度，觀察HBsAg含量的變化，一定要與FQ-PCR法測(cè)定HBV DNA含量相結(jié)合，才能更全面地掌握患者乙肝病毒復(fù)制程度及病毒蛋白合成水平，能為個(gè)體化治療提供更加科學(xué)可靠的依據(jù)。有助于判定治療終點(diǎn)或調(diào)整治療方案。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)感染病學(xué)會(huì).慢性乙型肝炎防治指南.實(shí)用肝臟病雜志,2006, 9（1）：1`16.

2 顏永乾.時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定乙型肝炎病毒表面抗原Cutoff值的確定.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2013,34（10）：1276.

3 Chan HL,Wong VW,Tse AM,et al.Serum hepatitis B surface antigen quantitation can reflect hepatitis B virus in the liver and predict treatment response.Clin Gastroenterol Hepatol,2007,46：S186.

4 蔣素貞,魯鳳民,莊輝.慢性乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的臨床意義.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012, 35（2）：117.

5 張欣欣,Stephen A,Locamin.HBsAg定量檢測(cè)在慢性乙型肝炎抗病毒治療監(jiān)測(cè)中的意義. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,33（1）：82～83.

6 Hui CK, Cheung WW, Au WY, et al. Hepatitis B reactivation after withdrawal of preemptive lamivudine in patients with haematological malignancy on completion of cytotoxic chemotherapy.Gut,2005,54（11）：1597～1603.

7 田沂,唐曉鵬,楊旭,等.HBV標(biāo)志物定量與病毒裁量關(guān)系探討.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2007,29（13）：1306.

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