兒童異型淋巴細(xì)胞增多與CMV、EBV感染相關(guān)性研究

章浙忠　許健駱豐　楊嘯曉

兒童異型淋巴細(xì)胞增多與CMV、EBV感染相關(guān)性研究

章浙忠許健★駱豐楊嘯曉

目的 探討患兒感染CMV、EBV后，異型淋巴細(xì)胞數(shù)量與CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平，以及與CMV-DNA和EBV-DNA之間的相關(guān)性，為患兒治療CMV和EBV提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法 收集異型淋巴細(xì)胞增多（陽(yáng)性：異型淋巴細(xì)胞＞3%）兒科臨床病例95例，采用ELISA法檢測(cè)患者血清中CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平，Real-time PCR法檢測(cè)患者CMV-DNA 和EBV-DNA含量，瑞吉染色計(jì)數(shù)異型淋巴細(xì)胞。結(jié)果 95例異型淋巴細(xì)胞陽(yáng)性患者體內(nèi)CMV-IgM和EBV-IgM陽(yáng)性率達(dá)1.1%和5.3%；CMV-IgG和EBV-IgG陽(yáng)性率為52.6%和31.6%；PCR結(jié)果顯示CMV-DNA和EB-DNA陽(yáng)性率分別為17.9%和22.1%。其中50例CMV-IgG檢測(cè)陽(yáng)性的患者CMV-DNA陽(yáng)性率高達(dá)30%；30例EBV-IgG檢測(cè)陽(yáng)性的患者EBV-DNA陽(yáng)性率高達(dá)36.7%；5例EBV-IgM檢測(cè)陽(yáng)性的患者僅1例EB-DNA檢測(cè)為陰性。結(jié)論 異型淋巴細(xì)胞增多與CMV、EBV感染具有一定的相關(guān)性，且CMV-IgG和EBV-IgG在診療過(guò)程中具有一定臨床意義。懷疑患兒感染CMV和EBV時(shí)，合并異型淋巴細(xì)胞、CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA水平聯(lián)合診斷對(duì)臨床具有重要意義。

異型淋巴細(xì)胞 巨細(xì)胞病毒 EB病毒

異型淋巴細(xì)胞又稱病毒細(xì)胞、非典型淋巴細(xì)胞、傳染性單核細(xì)胞等，多見(jiàn)于EB病毒（EBV）和巨細(xì)胞病毒（CMV）等感染［1］。傳染性單核細(xì)胞增多癥是指EBV感染引起的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)性增生性傳染病。但近期研究發(fā)現(xiàn)CMV病毒亦可引起傳染性單核細(xì)胞增多綜合征［2］，可經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)IgM抗體陽(yáng)性或PCR檢測(cè)DNA陽(yáng)性診斷［3，4］。作者對(duì)血液中存在異型淋巴細(xì)胞患者血清中的CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平以及EBV-DNA、CMV-DNA水平進(jìn)行檢測(cè)，并觀察CMV和EBV感染陽(yáng)性患者外周血中異型淋巴細(xì)胞的改變，綜合分析比較它們之間的聯(lián)系，為醫(yī)務(wù)人員診斷EBV和CMV感染提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2012年1月至2014年9月于浙江省中醫(yī)院兒科有異型淋巴細(xì)胞增多血液標(biāo)本95例，其中男45例，女50例；1～7歲占84.2%，其他年齡段占15.8%。

1.2儀器與試劑 雙目光學(xué)顯微鏡；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，USA，ABI7500）；酶標(biāo)儀（寶特，USA，ELX808）；EBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（達(dá)安基生物有限公司）； CMV病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（達(dá)安基生物有限公司）； CMV ELLSA試劑盒（美國(guó)美德聲科學(xué)技術(shù)公司）；EBV ELISA試劑盒（北京貝爾生物工程有限公司）。瑞吉染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3方法 （1）按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［5］的要求制備2張良好血涂片，瑞吉染液染色，異型淋巴細(xì)胞數(shù)＞3%為陽(yáng)性。（2）分離血清用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)血標(biāo)本中CMV-DNA和EBV-DNA水平。①標(biāo)本處理：患者靜脈血分離血清，取50μl血清加50μlDNA提取液混勻，離心后取含病毒DNA上清液5μl做PCR擴(kuò)增。②取預(yù)混有引物的PCR反應(yīng)管，加入含病毒DNA上清液，將反應(yīng)管放入PCR儀的樣品槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性、陽(yáng)性定量質(zhì)控參考品梯度以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類和循環(huán)參數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動(dòng)分析計(jì)算出標(biāo)本數(shù)值（Qty）。③陽(yáng)性判斷：CMVDNA＞2.5×104copies/ml；EBV-DNA＞5.0×104copies/ml。

2　結(jié)果

2.1瑞氏-吉姆薩染色液染色手工分類 95例標(biāo)本中89例為單核型的異型淋巴細(xì)胞，4例為單核型和和漿細(xì)胞型混合感染的異型淋巴細(xì)胞，2例為幼稚型的異型淋巴細(xì)胞。見(jiàn)圖1～3。

圖1　幼稚細(xì)胞型異型淋巴細(xì)胞

圖2　單核細(xì)胞型異型淋巴細(xì)胞

圖3　漿細(xì)胞型異型淋巴細(xì)胞

2.2異形淋巴細(xì)胞陽(yáng)性患者血清 CMV-IgM、IgG， EBV-IgM、IgG的 ELISA檢測(cè)結(jié)果以及EBV-DNA 、CMV-DNA 的PCR檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1　異型淋巴細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性血清CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG、EBV-DNA和CMV-DNA檢測(cè)結(jié)果（n）

2.3CMV-IgG和EBV-IgG陽(yáng)性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2　CMV-IgG和EBV-IgG陽(yáng)性患者中CMV-DNA和EBV-DNA 檢測(cè)結(jié)果（n）

2.4CMV-IgM和EBV-IgM陽(yáng)性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3　CMV-IgM和EBV-IgM陽(yáng)性患者血清CMV-DNA和EBV-DNA檢測(cè)結(jié)果（n）

3　討論

傳染性單核細(xì)胞癥臨床表現(xiàn)以小兒發(fā)熱、咳嗽、淋巴結(jié)和肝脾腫大等癥狀為主［6］。EBV是一種嗜B淋巴細(xì)胞的皰疹病毒，可引起典型的傳染性單核細(xì)胞增多癥表現(xiàn)［7，8］，或呈隱性感染狀態(tài)并終生帶毒［9，10］。文獻(xiàn)提示EBV可引起腦炎［11］、腦膜炎、多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。CMV具有潛伏-活動(dòng)的生物學(xué)特征［12］，可引起神經(jīng)性耳聾和不同程度的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙。異常淋巴細(xì)胞形態(tài)各異，一般分三型：Ⅰ型為泡沫型，其染色質(zhì)呈粗網(wǎng)或成堆排列，核偏位，胞漿中有大小不一泡沫樣空泡；Ⅱ型是不規(guī)則型，核圓、橢圓或不規(guī)則，染色質(zhì)稍細(xì)呈單核樣，胞漿豐富； Ⅲ型是幼稚型，染色質(zhì)細(xì)致均勻，可見(jiàn)核仁。對(duì)存在異型淋巴細(xì)胞患者的血清進(jìn)行CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA檢測(cè)，患者血清中CMV和EBV抗體的檢出說(shuō)明患者體內(nèi)存在CMV和EBV早期或既往感染，同時(shí)也論證了異型淋巴細(xì)胞與CMV和EBV具有一定的相關(guān)性。CMV和EBV感染后患者以Ⅱ型異常淋巴細(xì)胞為主，主要表現(xiàn)為胞漿增多，染色質(zhì)單核樣改變?yōu)橹鳎僖?jiàn)泡沫型和幼稚型。患者體內(nèi)出現(xiàn)的反應(yīng)性變異 T 淋巴細(xì)胞增多，故有淋巴結(jié)腫大的表現(xiàn)［13］。

CMV和EBV均屬皰疹病毒科，為雙鏈線狀DNA病毒［14］。兒童主要通過(guò)胎盤(pán)、母乳等方式感染CMV。當(dāng)小兒機(jī)體免疫缺陷或免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，則易引起肺炎或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙等疾病。EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特征，能夠在已產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在［15］。兒童感染EBV后癥狀表現(xiàn)不一，在早期易發(fā)生誤診［16］。CMV-IgM和EBV-IgM可作為急性感染的診斷指標(biāo)，因半衰期較短，可在體內(nèi)持續(xù)3個(gè)月。從患者血清中檢出IgM抗體，表明患者最近發(fā)生了病毒感染。CMV-IgG和EBV-IgG是既往病毒感染后，機(jī)體自身免疫產(chǎn)生的抗體，表明患者對(duì)該病毒具有免疫力。CMV和EBV DNA呈陽(yáng)性，表明患者體內(nèi)存在病毒感染。IgM陽(yáng)性、DNA陽(yáng)性，考慮急性的早期感染期已過(guò)，IgM型抗體在血中的滴度已下降，機(jī)體通過(guò)自身免疫開(kāi)始產(chǎn)生抗病毒的IgG，病毒還在機(jī)體內(nèi)不斷復(fù)制［17］。不容忽視的是，CMV和EBV均具有潛伏性，因此極有可能在潛伏期后，人體抵抗力低下時(shí)，又出現(xiàn)病毒活動(dòng)。因此兒童在CMV-IgG和EBVIgG檢測(cè)為陽(yáng)性，且符合病毒感染癥狀時(shí)，更應(yīng)注重CMV-DNA和EBV-DNA的及時(shí)檢測(cè)。對(duì)CMV-IgM和EBV-IgM陽(yáng)性患兒的血清同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)，當(dāng)IgM和DNA均呈陽(yáng)性時(shí)，既是發(fā)病早期又是病毒復(fù)制期（但兒童患者免疫反應(yīng)較弱，可呈假陰性），故應(yīng)積極治療，避免病情的加重。

不同方法的檢測(cè)結(jié)果代表著不同的臨床意義，ELISA法雖然特異性較高，但病毒需達(dá)到納克水平。PCR檢測(cè)具有敏感度高，快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但特異性不高。因此，懷疑患兒感染CMV和EBV時(shí)，對(duì)異型淋巴細(xì)胞以及CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG和EBV-DNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷具有重要的意義，為臨床醫(yī)生綜合分析病情，降低誤診，及早、及時(shí)、有效治療表明患者體內(nèi)存在病毒感染。IgG陽(yáng)性、DNA陽(yáng)性感染患兒提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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Objective Probe the correlation of atypical lymphocyte with CMV-IgM， CMV-IgG， CMV-DNA， EBV-IgM， EBV-IgG and EBV-DNA in pediatric patients， provide experimental basis for treatment of CMV and EBV infection in children patients. Methods Collected 95 samples of atypical lymphocyte more than 3% from clinic pediatrics， detected the level of CMV-IgM， CMV-IgG， EBV-IgM and EBV-IgG by ELISA， analyzed the copies of CMV-DNA and EBV-DNA with real time PCR， and the peripheral blood smears were stained by Wright-Giemsa. Results There were 1.1% CMV-IgM， 5.3% EBV-IgM， 52.6% CMV-IgG and 31.6% EBV-IgG positive were discovered in 95 children patients of atypical lymphocyte increased by ELIAS， 17.9% CMV-DNA and 22.1% EBV-DNA were confi rmed by PCR， respectively. 30% CMV-DNA positive patients were found at 50 samples with CMV-IgG； 36.7% EBV-DNA were found at 30 cases with EBV-IgG. There was only one EBV-DNA negative in 5 casws with EBV-IgM. Conclusion Results showed that atypical lymphocyte increased has correlation with CMV-DNA， EBV-DNA， CMV-IgG and EBV-IgG， it will provide a clinical reference for the diagnosis and treatment of CMV and EB infection.

Atypical lymphocyte CMV EBV

浙江省科技廳錢江人才項(xiàng)目（2013R10072）； 浙江省自然科學(xué)基金（LY14H160037）

310012 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（章浙忠 駱豐 楊嘯曉）310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院（許?。?通訊作者