糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9 CEA聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌早期診斷中的價(jià)值

滕衛(wèi)軍　朱以軍　陳燕萍　施昕　厲學(xué)民

糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9 CEA聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌早期診斷中的價(jià)值

滕衛(wèi)軍朱以軍陳燕萍施昕厲學(xué)民

目的 評(píng)價(jià)糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌早期診斷中的價(jià)值。方法 對(duì)2006年7月到2010年6月38例胰腺癌患者（早期8例、中晚期30例）和175例胰腺良性疾病患者的糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的陽(yáng)性率進(jìn)行比較和分析。結(jié)果 胰腺癌組糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的陽(yáng)性率顯著高于胰腺良性疾病組；早期胰腺癌組糞便K-ras12基因突變陽(yáng)性率顯著高于良性疾病組，而血清CA19-9、CEA的陽(yáng)性率與良性疾病組比較無(wú)顯著差異；中晚期胰腺癌組糞便K-ras12基因突變陽(yáng)性率顯著高于早期胰腺癌組，而血清CA19-9、CEA的陽(yáng)性率與早期胰腺癌組比較無(wú)顯著差異。糞便K-ras12基因突變、血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性分別為50%、37.5%、37.5%，特異性分別為89.7%、77.1%81.1%。用平行法聯(lián)合檢測(cè)糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性為87.5%、特異性74.2%；用系列法聯(lián)合檢測(cè)糞便K-ras基因突變和血清CA19-9、CEA診斷早期胰腺癌的敏感性為25%、特異性為94.9%。結(jié)論 糞便K-ras12基因突變和血清CA19-9、CEA的聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高診斷早期胰腺癌的敏感性和特異性。

胰腺腫瘤 K-ras12基因 腫瘤標(biāo)志物

胰腺癌的發(fā)病率在同內(nèi)外均逐年升高，但由于解剖位置關(guān)系以及缺乏特異有效的檢查手段，胰腺癌的早期診斷仍相當(dāng)困難［1］，血清腫瘤標(biāo)志物及相關(guān)腫瘤基因及蛋白表達(dá)的檢測(cè)為此提供了可能。其中，CA-199、K-ras12基因突變檢測(cè)被認(rèn)為對(duì)胰腺癌的診斷有很高價(jià)值，但是單一的檢測(cè)結(jié)果并不理想。有研究發(fā)現(xiàn)將上述指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可以彌補(bǔ)單一檢測(cè)的不足，并可將診斷率提高到90%以上［2、3］。本文旨在探討糞便K-ras基因第12位密碼子突變和CA-199、CEA聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌早期診斷中的作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2010年7月至2014年6月在本院住院的進(jìn)展期胰腺癌患者30例（男女各15例，年齡45～83歲），早期胰腺癌患者8例，所有胰腺癌患者均經(jīng)手術(shù)、病理或明確的影像學(xué)檢查證實(shí)。胰腺良性疾病患者175例（男98例、女77例，年齡32～82歲）。1.2 方法 （1）標(biāo)本的采集和RNA抽提：糞便DNA提取采用DNA抽提試劑盒步驟如下：取患者糞便5g溶于5ml 0.9%生理鹽水中，予離心機(jī)分離后取上清液1ml，加入等體積的DNA抽提?；靹蚝笳袷帯⑤腿?、離心后，上清用醋酸氨和無(wú)水乙醇沉淀，干燥，雙蒸水溶解保存。（2）檢測(cè)K-ras12密碼子突變：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）法。PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程為2次PCR及2次酶切。第1輪PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系包括10×ExTaq緩沖液5μl，dNTP混合液4μl，P10.5μl，P20.5μl，模板DNA≤1Ul，用無(wú)菌雙蒸水定容至50μl，PCR反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。第1輪酶切：取PCR產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶MvaI 1 Ul（10U/μl），37℃酶切1h；第2輪PCR反應(yīng)：取酶切產(chǎn)物5 uL，反應(yīng)體系及條件同第1次PCR反應(yīng)，僅引物換為P1和P3。第2輪酶切：取PCR產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶MvaI 1μl（10U/ μl），37℃酶切1h。取第2輪酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳后觀察結(jié)果。（3）CA-199、CEA檢測(cè)：全部患者于術(shù)前抽取靜脈血，經(jīng)發(fā)光免疫法測(cè)定，健康人的參考值分別為CA-199＜37U/mL，CEA＜5ng/ml。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組血清CA19-9、CEA、糞便K-ras12基因突變檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胰腺良性疾病組和胰腺癌組患者糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA的比較 見(jiàn)表1。

表1　各組患者糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA陽(yáng)性率的比較［n（%）］

2.2糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA對(duì)早期胰腺癌診斷效果比較 見(jiàn)表2。

表2　糞便K-ras12基因突變率及血清CA19-9、CEA對(duì)早期胰腺癌診斷效果的比較（%）

3　討論

早期的胰腺癌無(wú)典型癥狀，常被誤診，而使85%的患者喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此胰腺癌的早期診斷是直接影響胰腺癌患者預(yù)后的主要因素。胰腺癌的發(fā)生也是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，從致癌因素作用于正常細(xì)胞到形成臨床上可檢測(cè)的腫瘤常需要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)的潛伏期，亦提示一個(gè)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性表型之前必須經(jīng)歷多種變化。但Ras蛋白作為一種細(xì)胞信號(hào)因子，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中與細(xì)胞增殖之間的關(guān)系尚不清楚。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌發(fā)生與慢性胰腺炎病程呈正相關(guān)。若認(rèn)為胰腺癌發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，K-ras突變必定存在于癌前的增生性病變和癌組織中，而基因突變致基因表達(dá)水平的改變是細(xì)胞癌變的早期事件。因此有人認(rèn)為K-ras突變是腫瘤發(fā)生的早期環(huán)節(jié)，與腫瘤分期無(wú)關(guān)。K-ras基因突變?cè)谝认侔┲芯哂懈弑磉_(dá)，現(xiàn)已檢測(cè)出胰腺癌患者的組織、胰液、糞便和血液的K-ras基因突變。其中組織中K-ras基因突變的陽(yáng)性率最高達(dá)100%［4］。其次為胰液，陽(yáng)性率＞80%［5～7］，但上述方法大多具有創(chuàng)傷性而難以廣泛開(kāi)展，另外，很多患者由于不能耐受ERCP和組織學(xué)檢查而失去診斷機(jī)會(huì)。糞便K-ras基因突變的檢測(cè) 以其簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)、無(wú)創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了組織和胰液K-ras基因突變檢測(cè)的不足。本資料結(jié)果顯示8例早期胰腺癌患者中4例檢出k-ras12基因突變，敏感性50%，特異性89.7%；30例中晚期胰腺癌患者中26例檢出k-ras12基因突變，敏感性86.7%，特異性89.7%。良性組K-ras12基因突變率顯著低于早期胰腺癌組，提示K-ras12基因在早期胰腺癌即有顯著升高。但本資料亦發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌組K-ras12基因突變率顯著低于晚期胰腺癌組（P＜0.01），與Yamahita等［7］研究不相符，可能與本研究中早期胰腺癌樣本過(guò)少有關(guān)。

CA19-9、CEA是兩種較好的血清腫瘤標(biāo)志物，目前已廣泛用于胰腺癌的篩查，它由人的胰腺、膽管細(xì)胞及胃、結(jié)腸等處的上皮細(xì)胞合成，因此對(duì)于消化系統(tǒng)的腫瘤CA19-9、CEA均會(huì)有增高，只是血清水平不同而己。本資料對(duì)CA19-9、CEA的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)良性組CA19-9、CEA檢出率均顯著低于胰腺癌組。且早期胰腺癌組CA19-9檢出率及數(shù)值顯著低于晚期胰腺癌組，提示CA19-9、CEA對(duì)胰腺癌均有較強(qiáng)的敏感性。但CA19-9、CEA升高也可見(jiàn)于胃癌、結(jié)腸癌、膽囊癌、膽管癌等疾病，因此作者認(rèn)為CA19-9、CEA對(duì)消化系統(tǒng)的腫瘤有篩選的作用，它的敏感性尚可，但是特異性不高。

有學(xué)者報(bào)道，應(yīng)用腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合癌基因檢測(cè)的方法有較高的特異性和敏感性。本資料采用K-ras12基因和CA-199、CEA聯(lián)合檢測(cè)的方法彌補(bǔ)單一檢測(cè)的不足。結(jié)果證明，平行試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)（即三者中有一為陽(yáng)性）可提高敏感度到87.5%，特異度為74.2%。應(yīng)用系列試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)（即三者皆為陽(yáng)性）敏感度降為25%，特異度上升為94.9%。當(dāng)做平行聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，可提高胰腺癌診斷的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值，減少漏診的概率，由于特異性較差，此法較適用于門診患者的篩選。而系列聯(lián)合檢測(cè)則可提高診斷的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，提高診斷的準(zhǔn)確性。

1 陸星華.胰腺癌研究現(xiàn)狀與展望.胰腺病學(xué),2003,3（2）：63～65.

2 Futakawa N,Kimum W,Yamagata S,et a1.Significance of K-ras mutation and CEA level in pancreatic iuice in the diagnosis ofpancreatic cancer.J Hepatobiliary Pancreat Surg,2000,7（1）：63～71.

3 Myung SJ,Kim MH,Kim Y,et a1.Telomemse activity in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer may be complementary to K-ras mutation.Gastrointesti Endosc,2000,51（6）：708～713.

4 Tada M,Omta M,Ohta M,et al.Clinical application of ras gene mutation for diagnosis of pancreatic adenocarcinoma.Gastroenterolo gy,1991,100（1）：233～238.

5 Kmnra W,zhao B,Funtakana N,et al.Signifcance of k-ras codon 12 point mutation in pancreatic juice in the diagnosis of carcinoma of the pancreas. Hepatogastroenterology,1999,46（25）： 532～539.

6 Kaino M.Kondoh S，Okita S.et al.Detection of K-ras and p53 gene mutations in pancreatic juice for the diagnosis of intraductal papillary mucinous tumors.Pancreas 1999,l8：294～299.

7 Yamahita K,Kida Y,Shinoda H,et al .K-ras point mutations in the supernatants of pancreatic Juice and bile are reliable for diagnosis of panacreas and biliary and tract carcinomas complementary to cytologic Examination. Jpn J Cancer Res, 1999,90（2）：240～248.

Objective Abstract Objective To explore the value of combining the test of gene mutation of K-ras12 in stool samples and serum CA 199 and CEA for the early diagnosis of pancreatic cancer. Methods The gene mutation of K-ras12 in stool samples and elevated serum level of CA 199 and CEA of 38 cases of pancreatic cancer(8 cases of early stage, 30 cases of middle and late stage) and of 175 cases with pancreatic benign diseases from July, 2006 to June, 2010 were compared and analyzed. Results The gene mutation of K-ras12 in stool samples were signifi cantly higher in the early stage of pancreatic cancer, while the rate of elevated serum level of CA 199 and CEA was not signifi cantly different from the benign group; in the middle and late stage of pancreatic cancer, the gene mutation of K-ras12 in stool samples were signifi cantly higher while the rate of elevated serum level of CA 199 and CEA was not signifi cantly different from the benign group. The sensitivity rates of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA in the diagnosis of early pancreatic cancer were 50%、37.5%、37.5%，with the specifi city of 89.7%、77.1% and 81.1%, respectively. Combined test with paralleled method for the detection of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA has the sensitivity rate of 25% and the specifi city rate of 97.6%. Conclusions Combined test with paralleled method for the detection of gene mutation of K-ras12 in stool samples and the elevated serum level of CA 199 and CEA can signifi cantly increase the sensitivity rate and the specifi city rate for early pancreatic cancer.

Pancreatic tumor K-ras 12 gene Tumor marker

321000 浙江省金華市中心醫(yī)院