蛋氨酸腦啡肽對臍血來源CIK細胞作用的探索

李　瑋　周金懿　李大鵬

蛋氨酸腦啡肽對臍血來源CIK細胞作用的探索

李瑋周金懿李大鵬★

目的 嘗試采用蛋氨酸腦啡肽（MENK）增強臍血來源的細胞因子誘導殺傷細胞（CIK）的增殖能力和腫瘤細胞殺傷能力，探索如何有效縮短細胞治療周期并增強其療效。方法 以原有細胞因子配方聯(lián)合MENK作為觀察組，以原有配方為對照組，通過細胞計數(shù)和細胞殺傷實驗檢測MENK對臍血CIK細胞的作用。結(jié)果 在細胞培養(yǎng)的第9天、第12天，觀察組CIK細胞數(shù)量分別為（12.1±1.9）×109和（17.6±2.2）×109，高于同期對照組（9.4±1.3）×109和（10.7±1.7）×109；在腫瘤細胞殺傷試驗中，觀察組CIK的殺傷率在第9天、第12天分別為（49.82±1.86）%和（60.66±2.07）%，同期對照組殺傷率為（30.46±1.69）%和（50.46±1.94）%，觀察組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 在細胞因子誘導臍血來源單個核細胞成為殺傷細胞的過程中，MENK具有促進殺傷細胞增殖，增強腫瘤細胞殺傷能力的作用；可使臍血來源CIK提前達到回輸標準，縮短治療周期。

蛋氨酸腦啡肽 細胞因子誘導的殺傷細胞 臍血

細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK）是目前國內(nèi)應(yīng)用比較廣泛，療效比較明確的過繼性細胞免疫治療。患者自體細胞一直是CIK的主要來源，但亦存在不足，臍血來源是有效的補充。本實驗嘗試用蛋氨酸腦啡肽（Methionie-enkphalin，MENK）進一步增強臍血來源CIK細胞的增殖能力和殺傷腫瘤細胞能力，為縮短治療時間，擴大治療范圍，增強治療效果做探索。

1　材料與方法

1.1材料 臍血來自蘇州市臍血干細胞庫，MENK來自美國Penta Biotech Inc.公司，抗CD3 單抗、IL-2、IL-1α和RPMI1640來自上海晶美生物工程有限公司。SKM-1細胞系來自作者所在實驗室。CCK-8試劑盒來自武漢博士德生物公司。

1.2實驗方法 （1）臍血單個核細胞分離及CIK細胞培養(yǎng)：將臍帶血懸于Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液上，以2000rmp/min離心20min，將白膜層吸出后用RPMI1640清洗2次，調(diào)整細胞濃度至為1×105。培養(yǎng)液按組分別加入細胞因子配方，對照組為CD3mAb（20μg）+IL-1α（0.2μg）+IL-2（20萬IU）；觀察組為CD3mAb（20μg）+IL-1α（0.2μg）+IL-2（20萬IU）+MENK（10-12mg/ml）。（2）CIK細胞增殖能力檢測：對照組和觀察組CIK細胞，每組設(shè)3個復孔，分別于培養(yǎng)的0d、3d、6d、9d、12d，取各組細胞每孔懸液少許，觀察CIK細胞狀況，在全自動五分類血液分析儀上進行細胞計數(shù)，檢測細胞數(shù)量，以3孔平均值為當天該組細胞數(shù)量。（3）CIK細胞殺傷腫瘤活性檢測：以培養(yǎng)9d、12d的CIK細胞為效應(yīng)細胞，SKM-1細胞為靶細胞，按效/靶比（10：1）將觀察組與對照組CIK細胞分別于SKM-1細胞混合。同時設(shè)SKM-1細胞孔，觀察組與對照組CIK細胞孔和培養(yǎng)基空白對照孔。兩組在各時間點均設(shè)3 個平行孔，置于細胞培養(yǎng)箱中12 h后，每孔加入10μlCCK-8，混勻，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱4h后用酶標儀測定每孔450 nm 波長處的OD值。細胞毒活性的計算方法：以3個平行孔的均值，按以下方法計算CIK細胞毒活性，用殺傷率表示。細胞毒活性=［1-（效靶細胞作用孔OD值-效應(yīng)細胞孔OD值）］/靶細胞孔OD值×100%。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件分析。均值比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1MENK對臍血來源CIK細胞增殖力的作用 見表1。

表1　MENK對臍血來源CIK細胞數(shù)量影響［×109，（x±s）］

2.2MENK對臍血來源CIK細胞殺傷腫瘤活性的作用 見表2。

表2　MENK增強臍血來源CIK殺傷腫瘤細胞能力［%，（x±s）］

3　討論

細胞因子誘導CIK是過繼免疫細胞療法的一種，目前國內(nèi)應(yīng)用較多，在全身靜脈應(yīng)用和體腔應(yīng)用均有比較明確的治療效果［1］。目前，仍然有不少患者需要進行免疫治療，但因各種原因，不能采用自己的細胞。在這種情況下，臍帶血細胞為一個可行的選擇［2］。但是臍帶血中單個核細胞數(shù)量較少［3］，如何更有效、更穩(wěn)定地增殖殺傷細胞是一個亟待解決的技術(shù)問題。

MENK是腦啡肽（Enkephalin，ENK）的一種，在人體中分布廣泛，除了具有鎮(zhèn)痛作用和神經(jīng)保護作用，還具備免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用［4］。MENK通過與免疫細胞表面的δ受體、μ受體結(jié)合，可激活免疫細胞并增加小鼠T細胞活性，其效果有劑量依賴性［5］。MENK對人體免疫細胞的具體作用也有一定的研究，結(jié)果顯示在10-12mol/L濃度時，MENK對人體免疫細胞也有顯著的增強活性作用［6］。國內(nèi)也有MENK制劑直接應(yīng)用于人體的臨床研究，MENK明顯改善了患者的免疫功能［7］。但是關(guān)于MENK在CIK領(lǐng)域的研究較欠缺的。

本資料結(jié)果顯示，在細胞因子誘導臍血來源單個核細胞成為殺傷細胞的過程中，MENK具有促進CIK增殖，增強腫瘤細胞殺傷能力的作用。姚春等［7］研究證實臍血CIK細胞在抗白血病多藥耐藥方面有獨特的優(yōu)勢，是緩解白血病細胞多藥耐藥的新途徑之一，而MENK的作用增強了這一途徑的可行性。MENK對于臍血來源單個核細胞作用的具體途徑是否與之前的研究結(jié)果一致，還有待于進一步研究。

1 Zhong R,Teng J,Han B,et al. Dendritic cells combining with cytokineinduced killer cells synergize chemotherapy in patients with latestage non-small cell lung cancer. Cancer Immunol Immunother,2011,60（10）：1497～1502.

2 姚春,宋善俊.臍血CIK細胞對耐藥白血病細胞體外殺傷效應(yīng)及其機制的研究. 臨床血液學雜志,2008,21（7）： 369～372.

3 Theilgaard-Monch K, Raaschou-Jensen K, Palm H, et al. Flow cytometric assessment of lymphocyte subsets,lymphoid progenitors,and hematopoietic stem cells in allogeneic stem cell grafts. J Exp Med,2002, 195（5）： 637～641.

4 Fengping Shan,Yanjie Xia. Functional modulation of the pathway between dendritic cells（DCs）and CD4 + T cell by the neuropeptide：Methionine enkephalin（MENK）. Peptides,2011,5（32）： 929～937.

5 Zagon Ian S,Donahue Renee N,Bonneau Robert H,et al. T lymphocyte proliferation is suppressed by the opioid growth factor（Met5）-enkephalin）opioid growth factor receptor axis： Implication for the treatment of autoimmune diseases. Immunobiology,2011,216（5）： 579～590.

6 Liu J,Chen W, Meng J, et al. Induction on differentiation and modulation of bone marrow progenitor of dendritic cell by methionine enkephalin（MENK）. Cancer Immunol Immunother,2012,61（10）： 1699～1711.

7 Wang DN,Meng JJ,Lv CL,et al. Immune system restore 0n terminal cancer patients by bio-peptide： Methionine Enkephalin（MEK）. Journal of microbiology,2008,28（5）： 39～41.

Objective To observe whether the cytotherapy period was cut or not，and the effect of proliferation and cytotoxicity of cytokine induced killer cells（CIK）derived from cord blood by application of Methionine Enkephalin（MENK）. Method All mononuclear cells from cord blood were divided into 2 groups，the control group cultivated with original cytokine formula，while the test group with the combination of MENK and the original. The effect was investigated by cell counting and cytotoxicity test. Result Both of the Results in proliferation and cytotoxicity test were signifi cantly higher in test group than in control group（P＜0.05）. The cells count showed（12.1±1.9）×109and（17.6±2.2）×109in test group at Day 9 and Day 12 respectively during cultivation，more than（9.4±1.3）×109and（10.7±1.7）×109in control. While the cytotoxicity rate of CIK revealed（49.82±1.86）% and（60.66±2.07）% in test group，comparing with（30.46±1.69）% and（50.46±1.94）% in control. Conclusion It was illustrated that the capability of proliferation and cytotoxicity promoted in CIK derived from mononuclear cells in cord blood by utilizing MENK and the cytotherapy period shortened as well.

Methionine enkephalin（MENK） Cytokine-induced killer cells（CIK） Cord blood

215006 蘇州大學附屬第一醫(yī)院* 通訊作者