HBV感染后慢性化進(jìn)展過(guò)程中miRNA表達(dá)HBV基因型 P基因點(diǎn)突變的研究

敖家富　冀文娟　張　靜　顧國(guó)浩蔣敏

HBV感染后慢性化進(jìn)展過(guò)程中miRNA表達(dá)HBV基因型 P基因點(diǎn)突變的研究

敖家富冀文娟張靜顧國(guó)浩★蔣敏

目的 探討HBV感染引起的肝臟病變慢性化進(jìn)展為慢性乙肝、肝硬化、肝癌之相關(guān)因素，分析各因素在肝臟病變慢性化演變過(guò)程中的作用及在診斷、治療、判斷預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用xMAP液態(tài)芯片技術(shù)定量檢測(cè)HBV相關(guān)肝病標(biāo)本中PBMCmiR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372的表達(dá)水平；采用直接測(cè)序法檢測(cè)相應(yīng)血清標(biāo)本HBV基因型及P基因區(qū)耐藥位點(diǎn)突變；對(duì)HBV相關(guān)肝病慢性化進(jìn)展的各可能相關(guān)因素包括性別、年齡、HBV基因型、HBV DNA載量水平、HBeAg狀態(tài)、miRNA表達(dá)水平作多因素Logistic回歸分析，探討參與HBV感染引起的肝臟病變慢性化演變過(guò)程的相關(guān)因素。結(jié)果 HBV C基因型、DNA載量持續(xù)高水平表達(dá)、miR-20a表達(dá)上調(diào)、miR-126及miR-223表達(dá)下調(diào)是在乙肝慢性化進(jìn)展中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素（P＜0.05），而HBeAg狀態(tài)、自然狀態(tài)下發(fā)生的耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變，年齡、性別等因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 C基因型，HBV DNA持續(xù)高載量以及miR-126、-223低表達(dá)，miR-20a高表達(dá)可能是導(dǎo)致乙肝慢性化的相關(guān)因素，尤其可能是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因子，常規(guī)檢測(cè)基因型、HBV DNA及miRNA的定量檢測(cè)可為監(jiān)測(cè)病情、判斷預(yù)后、及時(shí)治療預(yù)防乙肝慢性化進(jìn)展提供資料。

HBV基因型 xMAP液態(tài)芯片 miRNA P基因突變

乙型病毒性肝炎是世界范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，我國(guó)是乙肝感染大國(guó)，全國(guó)1～59歲人群乙肝表面抗原攜帶率為1.18%［1］，80%～90%的急性HBV感染者可發(fā)展為慢性乙型肝炎（CHB），其中20%～30%可發(fā)展為肝硬化（LC）或肝癌（HCC）。在我國(guó)約90%的肝細(xì)胞癌患者均合并HBV感染［2］。作者通過(guò)收集未曾服用核苷類(lèi)抗病毒藥物的病例，采用直接測(cè)序法檢測(cè)HBV DNA P基因區(qū)部分序列并對(duì)其分型，將HBV基因型及P基因區(qū)自發(fā)耐藥相關(guān)突變、性別、年齡、HBV DNA載量水平、HBeAg狀態(tài)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，探討參與HBV感染者肝病慢性化進(jìn)展的相關(guān)因素。

1　材料與方法

1.1一般資料 收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院及亳州市人民醫(yī)院2010年10月至2011年12月住院和門(mén)診HBV感染者169例，其中男126例，女43例；年齡（45.51±12.87）歲。其中急性乙型肝炎（AHB）患者40例、慢性乙型肝炎（CHB）患者53例、肝炎后肝硬化（LC）患者44例、HCC患者32例及健康對(duì)照（NC）40例，診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，每例樣本采集外周血1ml，立即提取單個(gè)核細(xì)胞后抽提總RNA，并保存相應(yīng)血清1ml -80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法 （1）主要試劑和儀器：天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（天根）、Taq酶（TAKARA/ C，DR001B）、BigDye Terminatory3.1 Cycle（AB，4336913）、天根乙型肝炎病毒及耐藥突變檢測(cè)試劑盒（天根）、微球（Bio-Rad）、地址序列探針（上海生工）、1.5×TMAC緩沖液（Sigma）、Streptavidin R-phycoerythrin，conjugate（1mg/ml，INVITROGEN）、RNA-DNA嵌合探針（上海吉瑪生物）、Rnase A（sigma）、Thermo Spectronic紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Spectronic）、MyCycler PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）、Luminex 200（Luminex）、 PCR儀為ABI9700、測(cè)序儀ABI3730XL、Light Cycler Real Time PCR擴(kuò)增儀（Roche）。（2）液體芯片法檢測(cè)miRNA：將所有標(biāo)本上PCR儀與嵌合探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)過(guò)微球雜交、酶切反應(yīng)、熒光信號(hào)檢測(cè)，以miR-103為內(nèi)參（取3次讀數(shù)平均值作為有效內(nèi)參照數(shù)值），將標(biāo)本的（靶miRNA分子平MFI-對(duì)應(yīng)本底MFI）/（miR-103MFI 對(duì)應(yīng)本底MFI）的比值作為有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。（3）HBV DNA定量測(cè)定：PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件為HBV DNA提取液4μl，PCR反應(yīng)液21μl，42℃5min，94℃5min，（94℃5s，60℃40s）×40cycles，37℃恒溫。（4）測(cè)序：PCR體系及循環(huán)條件為HBV DNA模板2μl、BigDye Mix 2μl、引物（3.2pmol）1μl，96℃1min，（96℃10s，51℃ 10s，60℃ 3min10s）×25cycles，12℃保溫。（5）基因分型：用EDTA-酒精純化PCR產(chǎn)物，用去離子甲酰胺溶解后上3730XL測(cè)序并進(jìn)行分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。Kolmog orov-Smirnov檢驗(yàn)法作數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，將HBV感染后疾病轉(zhuǎn)歸的可能相關(guān)因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析（累積Logistic模型）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1xMAP液態(tài)芯片技術(shù)檢測(cè)各組miRNA結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1　HBV相關(guān)肝病慢性化進(jìn)展不同時(shí)期PBMC中的miRNA的表達(dá)結(jié)果（x±s）

2.2HBV感染后肝病慢性化演變不同階段的HBV DNA P基因區(qū)點(diǎn)突變及分型結(jié)果 見(jiàn)表2及表3。

表2　不同基因型感染的乙肝患者的臨床特征［n（%）］

表3　HBV感染相關(guān)肝病慢性化進(jìn)展不同臨床階段P區(qū)耐藥突變位點(diǎn)及變異方式

2.3HBV感染相關(guān)肝病慢性化進(jìn)展不同臨床階段自發(fā)突變位點(diǎn)相關(guān)的LAM/ETV耐藥情況 見(jiàn)表4。

表4　HBV感染肝病慢性化進(jìn)展不同時(shí)期自發(fā)突變位點(diǎn)相關(guān)的LAM/ETV耐藥情況［n（%）］

2.4HBV感染相關(guān)肝病慢性化進(jìn)程中多因素有序Logistic回歸分析 根據(jù)單因素方差/卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果剔除變量miR-372、-21、-145、-222、-191（P＞0.05）；將AHB、CHB、LC、HCC這四個(gè)HBV感染后肝病慢性化嚴(yán)重程度逐漸加重的不同時(shí)期作為應(yīng)變量Y，為多分類(lèi)有序變量，其余變量作為協(xié)變量，進(jìn)入Ordinal過(guò)程進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，剔除變量HBeAg狀態(tài)、性別、耐藥突變（P＞0.05），將其余變量代入Ordinal過(guò)程進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素。模型診斷比檢驗(yàn)顯示回歸模型有意義（χ2=355.70，P＜0.05），模型的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)（Pearson=379.50，P=1.00），偏差檢驗(yàn)（χ2=107.43，P=1.00）顯示模型擬合度良好。分析結(jié)果表明基因型C、HBV DNA高水平、miR-20a表達(dá)上調(diào)、miR-126和miR-223表達(dá)下調(diào)與乙肝的慢性化進(jìn)展有關(guān)。

3　討論

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸（nt）的一種以序列特異性方式轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的非編碼單鏈RNA，成熟miRNA可與其他蛋白一起組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)以完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)方式在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程［4］。本研究選用表達(dá)穩(wěn)定的miR-103做內(nèi)參［5］，以相對(duì)定量法對(duì)miR-222、-191、-145、-21、-223、-31、-126、-20a、-372做相對(duì)定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HBV感染相關(guān)肝病慢性化進(jìn)展不同階段PBMC中miRNA-145、-222、-31、-21、-372表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示可能與乙肝慢性演化及致病性無(wú)關(guān)。HBV感染相關(guān)肝病慢性演變過(guò)程中miR-20a表達(dá)顯著上調(diào)，NC組表達(dá)量最低，HCC組表達(dá)最高，且隨著慢性化進(jìn)展其表達(dá)量逐漸增高，提示miR-20a的上調(diào)不僅參與了乙肝慢性化過(guò)程，且可能是乙肝性肝癌一個(gè)重要致病性miRNA分子。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-126在肝臟組織的表達(dá)特異性較高［6］，本研究中HBV感染相關(guān)肝病PBMC中表達(dá)量相對(duì)于NC組是下調(diào)的，且隨著疾病慢性化的進(jìn)展下調(diào)的幅度越大，在HCC組miR-126的表達(dá)最低。本研究中miR-223在AHB組表達(dá)最高，提示急性感染期miR-223增高可能是一過(guò)性的急性反應(yīng)性增高，從急性感染期進(jìn)展為CHB、LC及HCC的過(guò)程中，其表達(dá)逐漸下調(diào)，提示miR-126及-223的下調(diào)可能與HBV相關(guān)肝病慢性化的進(jìn)展有關(guān)。針對(duì)HBV相關(guān)肝病開(kāi)展miRNA表達(dá)譜的研究，可為HBV急性感染到慢性化發(fā)展機(jī)制提供一個(gè)新的研究角度。

HBV基因型與患者的傳播方式、病情進(jìn)展、臨床轉(zhuǎn)歸有一定聯(lián)系，感染后臨床轉(zhuǎn)歸不僅取決于患者感染時(shí)的年齡和免疫力，也與感染病毒株的基因型關(guān)系密切。本研究結(jié)果的基因型以B和C型為主，在檢測(cè)的169例標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)其他型別的病毒株?；蛐驮诓煌琀BV肝病慢性化進(jìn)展的不同時(shí)期的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨著病情的進(jìn)展，C基因型的概率越高，提示C基因型可能與乙肝的慢性化進(jìn)展有關(guān)，更易導(dǎo)致患者發(fā)生更嚴(yán)重的肝病。乙肝慢性化進(jìn)展過(guò)程是一個(gè)機(jī)體和病毒多因素相互作用的結(jié)果，本研究收集未經(jīng)過(guò)抗病毒治療的HBV感染者完整的臨床信息，結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析篩選出HBV DNA載量、基因型和miR-20a、miR-223、miR-126是乙肝慢性化進(jìn)展的影響因素，推測(cè)其可能是HBV感染后慢性化進(jìn)展為肝硬化至肝癌的推動(dòng)因素，為探索乙肝的慢性化進(jìn)展機(jī)制、臨床預(yù)防、治療、判斷預(yù)后提供參考。

1 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.全國(guó)人群乙肝血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果.北京：衛(wèi)生部,2008.

2 Thakur V,Guptan RC,Kazim SN,et al.Profile,sepectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent.J Gastroenterology and Hepatol,2002,17（2）：165～170.

3 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指（2010年版）.中華肝臟病雜志,2011,19（1）：13～24.

4 BartelDP.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,andfunction. Cell 2004,116（2）：281～297.

5 Peltier HJ,Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：Identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues.RNA,2008, 14： 844～852.

6 Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et a1.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.Cell,2007, 129（7）：1401～1414.

HBV genotype xMAP liqued chip miRNA P gene mutation

236800安徽省亳州市人民醫(yī)院（敖家富 冀文娟張靜）

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院（顧國(guó)浩 蔣敏）

【Abstrat】 Objective To explore the related factors of HBV in the process of its chronic development，and to analyze their roles in the HBV chronic evolution and appraise their value of diagnosis，treatment and prognosis. Methods Establishing the detection Methods of miRNA（miR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372）in peripheral blood mononuclear cell of HBV infected patients by xMAP bead-based suspension array，and use the technology to detect the expression of miRNA in different HBV infected periods.Using direct sequencing method to detect matching serum sample's HBV genotype and P gene area resistance locus mutation，and analyze gender，age，HBV genotype，HBV DNA load level，gene mutation，miRNA expression level，HBeAg state by Logistic regression analysis，dicuss which related with the disease outcomes after infected HBV and play great roles in the chronic evolution. Results HBV genotype C，the continuous high level expression of DNA loads，miR-20a expression，miR-126 and miR-223 expression were infl uence factors in progress of chronic hepatitis B（P<0.05），while the HBeAg status，natural occurrence of drug resistance related locus mutation，age，gender had no statistical signifi cance（P>0.05）with the chronic progress. Conclusion C genotype，HBV DNA continuous high loads，high expression of miR-20a and low expression of miR-126，-223 maybe the related factors of hepatitis B chronic evolution，especially maybe the liver cancer risk factors.the conventional detect genotype，HBV DNA and miRNA for monitoring，prognosis and timely treatment to prevent chronic hepatitis B developed to LC and HCC provide information.