結(jié)晶紫高效脫色菌株的篩選、鑒定與脫色特性

摘要：結(jié)晶紫是一類(lèi)難以降解且對(duì)許多生物都具有致癌致畸性的三苯甲烷類(lèi)染料，篩選能夠高效脫色結(jié)晶紫的菌株對(duì)修復(fù)受污染水體具有重要意義。從浙江溫州分離篩選到1株結(jié)晶紫高效降解菌株CV-b，系統(tǒng)地研究了各操作因素對(duì)該菌株脫色結(jié)晶紫的影響。經(jīng)16S rRNA基因序列分析表明，該菌株屬于腸桿菌屬（Enterabacter sp.）。當(dāng)pH值在3.0～10.0之間時(shí)，培養(yǎng)24 h以后，該菌株對(duì)50 mg/L結(jié)晶紫的脫色率均在50%以上；脫色的最適溫度范圍為 25～35 ℃；多數(shù)供試碳源對(duì)脫色有顯著促進(jìn)效應(yīng)，而多數(shù)供試氮源則對(duì)脫色無(wú)顯著影響；供試金屬離子中，Cu2+、Fe3+和Zn2+對(duì)脫色有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)結(jié)晶紫的脫色與對(duì)數(shù)模型擬合度較高（r2=0.942 7）。經(jīng)脫色前后的全波長(zhǎng)掃描分析顯示，菌株CV-b對(duì)結(jié)晶紫的脫色是由生物降解引起的?？傮w而言，菌株CV-b在結(jié)晶紫脫色中的實(shí)際應(yīng)用潛能較大。

關(guān)鍵詞：腸桿菌屬（Enterabacter sp.）；結(jié)晶紫；脫色特性；動(dòng)力學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： X703；Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0378-03

工業(yè)廢水中的污染物種類(lèi)繁多，其中合成染料對(duì)環(huán)境的影響極為惡劣，廢水中的染料泄漏至環(huán)境水體中，導(dǎo)致被污染水體色度增大，進(jìn)而影響水生動(dòng)植物的生態(tài)平衡。而且，多數(shù)合成染料對(duì)動(dòng)物和水生生物的毒害性較大，加之分子結(jié)構(gòu)中多含有穩(wěn)定性極強(qiáng)的苯環(huán)，導(dǎo)致其極難在環(huán)境中自然降解[1-2]。如何從廢水中移除合成染料已經(jīng)成為科研工作者亟待解決的一個(gè)難題。在眾多不同種類(lèi)的合成染料中，三苯甲烷類(lèi)染料是印染行業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)染料，約占所有合成染料的30%～40%[3-4]。結(jié)晶紫（crystal violet，CV）是一類(lèi)典型的三苯甲烷類(lèi)染料，廣泛應(yīng)用于印染、生物和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。然而由于結(jié)晶紫的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，極難被微生物降解，導(dǎo)致其在環(huán)境水體中長(zhǎng)時(shí)間存在，進(jìn)而危害水生生物[5]。許多研究者嘗試用不同的處理方法移除廢水中的結(jié)晶紫染料，例如化學(xué)氧化還原法、物理沉淀或絮凝、光催化氧化、吸附、電化學(xué)處理、反滲透技術(shù)和生物降解等[5]。其中，生物降解作為一種環(huán)境友好型且高效低耗的處理手段而越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注[6-7]。而國(guó)內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌降解結(jié)晶紫染料的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本研究從浙江溫州水頭皮革廢水重污染區(qū)域篩選到1株結(jié)晶紫高效降解菌株，在此基礎(chǔ)上，本研究旨在初步鑒定菌株CV-b，并采用單因素試驗(yàn)研究該菌株對(duì)結(jié)晶紫的脫色特性以及脫色動(dòng)力學(xué)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種來(lái)源供試土樣取自浙江溫州水頭，菌株CV-b來(lái)源于皮革廢水底泥中。

1.1.2試劑結(jié)晶紫，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染色液；TE緩沖液；Tris飽和酚（pH值8.0）；氯仿；10×PCR緩沖液、DNA 連接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）；DNA 純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）等。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM，pH值7.0）：15.13 g/L Na2HPO4，3.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl，0.491 g/L MgSO4·7H2O，0.026 g/L CaCl2·2H2O。LB培養(yǎng)基pH值（7.0～7.2）：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl。純化培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基中添加終濃度為100 mg/L的CV染料。用于動(dòng)力學(xué)研究的培養(yǎng)基（pH值6.2）：1.0 g/L木糖，1.0 g/L谷氨酸，0.5 mmol/L ZnCl2，50 mg/L CV。

1.2試驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；高壓蒸汽滅菌鍋；全溫恒溫?fù)u床；電子天平；pH計(jì)；高速冷凍離心機(jī)；Evolution 300紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)；Bio-rad PCR儀；自動(dòng)凝膠圖像分析儀及水平電泳儀等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1CV高效降解菌株的富集、分離和純化方法將10 g土樣置于100 mL無(wú)菌水中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩30 min后取出，待土水分離后，取10 mL上層懸液接入已滅菌的含10 mg/L CV為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基（100 mL）中。于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)1周后，吸取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至含20 mg/L CV的新鮮培養(yǎng)基中，連續(xù)馴化、富集。轉(zhuǎn)接多次后，培養(yǎng)物可耐受的CV終濃度為100 mg/L。用接種環(huán)蘸取少許富集培養(yǎng)液，在純化培養(yǎng)基平板上直接劃線分離。在平板上選擇不同形態(tài)特征的單菌落，重新轉(zhuǎn)接至含100 mg/L CV的純化培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)接多次直至獲得單一形態(tài)的CV降解菌純培養(yǎng)物。

1.3.2菌株CV-b 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與序列分析具體方法參見(jiàn)都林娜等介紹的方法[8]。

1.3.3菌株CV-b對(duì)CV的脫色特性研究（1）培養(yǎng)基起始pH值對(duì)脫色的影響。用1.0 mol/L的HCl或NaOH將2.0 g/L酵母粉溶液的初始pH值分別調(diào)整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。滅菌后添加過(guò)濾除菌的CV，使其終濃度為50 mg/L，接種等量菌株CV-b過(guò)夜培養(yǎng)物（干質(zhì)量，0.15 g/L），并于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)溫度對(duì)脫色的影響。分別設(shè)定培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35、40 ℃，pH值為7.0左右，接種培養(yǎng)方法同（1）。（3）碳氮源對(duì)脫色的影響。將供試碳源（葡萄糖、乳糖、D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-木糖和淀粉）分別添加至MSM培養(yǎng)基中，使其終濃度為 2.0 g/L。將供試氮源（NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸）分別添加至無(wú)NH4Cl的MSM培養(yǎng)基中，使其終濃度為20 g/L。接種和培養(yǎng)方法同（1）。（4）金屬離子對(duì)脫色的影響。分別向2.0 g/L的酵母粉溶液（pH值7.0）中添加終濃度為1.0、2.0 mmol/L的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，接種和培養(yǎng)方法同（1）。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，并同時(shí)設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.4菌株CV-b對(duì)CV的脫色動(dòng)力學(xué)研究接種后于30 ℃條件下培養(yǎng)，在一定的時(shí)間間隔內(nèi)從三角瓶中吸取 4 mL 樣品，于10 000 r/min條件下離心10 min，上清液用于測(cè)定脫色率。

1.3.5菌株CV-b對(duì)CV脫色前后的全波長(zhǎng)掃描分析在MSM培養(yǎng)基中添加終濃度為50 mg/L的CV，接種后于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，取4 mL樣品，于10 000 r/min條件下離心10 min，上清液用Evolution 300紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，同時(shí)設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)。

1.4脫色率計(jì)算

將混合培養(yǎng)物在10 000 r/min條件下離心10 min后，取上清，用Evolution 300紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在580 nm（CV的λmax）處測(cè)定吸光度。對(duì)照試驗(yàn)為同等條件下不接菌的試驗(yàn)組。脫色率通過(guò)以下公式計(jì)算：

脫色率=Dc-DfDc×100%。

式中：Dc為對(duì)照試驗(yàn)組的吸光度；Df為接種并培養(yǎng)一定時(shí)間后染料溶液的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1CV高效降解菌株的篩選與鑒定

經(jīng)多次富集、純化培養(yǎng)后，篩選到一株對(duì)CV脫色效果較好的菌株，命名為CV-b。革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株是革蘭氏陰性菌，桿狀。

以菌株CV-b基因組為模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)PCR產(chǎn)物、回收、純化后測(cè)序，獲得1476 nt的CV-b菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登錄序號(hào)為KF956723。將該序列經(jīng)與GenBank中的數(shù)據(jù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其相似度與Enterobacter sp. AP11的相似度達(dá)到97%以上，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中也與該菌株聚類(lèi)在一起，表明該菌株屬于腸桿菌屬（Enterobacter sp.）。

2.2菌株CV-b對(duì)CV的脫色特性

2.2.1初始pH值對(duì)CV脫色的影響由圖1可知，培養(yǎng) 24 h 后，pH值在3.0～10.0之間時(shí)，該菌株對(duì)50 mg/L的CV脫色率均在50%以上，說(shuō)明該菌株對(duì)CV脫色的pH適應(yīng)性較強(qiáng)，實(shí)際應(yīng)用潛力較大。同時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基pH值偏酸性的情況下，該菌株對(duì)CV的脫色率仍較高，最適脫色pH值位于3.0～40之間。以往的報(bào)道顯示，多數(shù)菌株對(duì)染料進(jìn)行脫色的最適pH值為中性范圍，如Ayed 等在研究Bacillus sp.菌株對(duì)CV的降解特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫色的最適pH值為7.0左右，而偏酸或偏堿對(duì)脫色的抑制效果都較為顯著[9]；無(wú)獨(dú)有偶，胡起靖等在研究一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)結(jié)晶紫的脫色條件時(shí)也發(fā)現(xiàn)，脫色的最適pH值為中性，偏酸或偏堿會(huì)對(duì)脫色有顯著的抑制效果[10]。與以往報(bào)道相比，菌株CV-b在偏酸或偏堿性條件下均有較好的脫色效果，pH適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠適應(yīng)實(shí)際廢水處理過(guò)程中含染料廢水偏酸或偏堿的情況，故而實(shí)際應(yīng)用潛能較大。

2.2.2溫度對(duì)CV脫色的影響由圖2可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，溫度為25～35 ℃之間時(shí)，該菌株對(duì)50 mg/L的CV脫色率均在50%以上。隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株對(duì)CV的脫色率也隨之升高。

2.2.3碳氮源對(duì)CV脫色的影響試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，多數(shù)供試碳源對(duì)CV脫色無(wú)顯著影響或有促進(jìn)效應(yīng)，其中以麥芽糖、果糖和木糖的促進(jìn)效果最為顯著，總體而言，供試碳源中以木糖對(duì)CV脫色的促進(jìn)效果最好。不同的菌株對(duì)CV進(jìn)行脫色的最適碳源不盡相同，多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)的CV生物脫色的最適碳源為葡萄糖，如Cheriaa等在研究Sphingomonas paucimobilis對(duì)CV脫色的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，脫色的最適碳源為葡萄糖[11]，而不同菌株對(duì)不同碳源的偏好性的原因尚不清晰。

氮源對(duì)CV脫色的影響如圖4所示。與碳源相比，多數(shù)供試氮源對(duì)CV脫色均無(wú)顯著影響或有顯著抑制效應(yīng)，僅谷氨酸對(duì)脫色有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。

2.2.4金屬離子對(duì)CV脫色的影響由圖5可知，無(wú)論濃度為1 mmol/L或2 mmol/L，在供試金屬離子中Ca2+、Mg2+和Mn2+均對(duì)CV脫色有顯著抑制效應(yīng)，而Cu2+、Fe3+和Zn2+則對(duì)CV脫色有顯著促進(jìn)效應(yīng)，其中尤以Fe3+的促進(jìn)效果最佳。但考慮到Fe3+本身有絮凝效果，且經(jīng)離心后的菌體沉淀呈現(xiàn)紫色，因此，后期未在培養(yǎng)基中添加Fe3+作為脫色促進(jìn)因子，而是選取了促進(jìn)效果次之的Zn2+作為脫色促進(jìn)因子。

2.3菌株CV-b對(duì)CV的脫色動(dòng)力學(xué)特性

菌株CV-b對(duì)CV的脫色動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，該菌株對(duì)CV脫色的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以很好地?cái)M合為如下動(dòng)力學(xué)模型：y=4.672ln（t）+55.18（r2=0.942 7），y為脫色率，t 為脫色時(shí)間。此外，由圖6可知，經(jīng)培養(yǎng)24 h后，該菌對(duì)50 mg/L的CV脫色率可以達(dá)到70%以上。根據(jù)以往報(bào)道，由于培養(yǎng)條件和接種量等差異，不同的菌株對(duì)CV的脫色率也各不相同，如Yatome等在研究Nocardia coralline 降解CV時(shí)發(fā)現(xiàn)，在CV濃度達(dá)到7 μmol/L（約3 mg/L）以上時(shí)，該菌株對(duì)CV的脫色就完全被抑制[12]；譙建軍等在研究細(xì)菌Kingella H共降解CV的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CV濃度達(dá)到38 mg/L時(shí)，脫色率僅為30%左右[13]；Chen 等的研究表明，經(jīng)過(guò)1周的培養(yǎng)后，菌株P(guān)seudomonas putida 對(duì) 60 μmol/L （約25 mg/L）左右的CV脫色率為80%左右[5]；Cheriaa等發(fā)現(xiàn)Sphingomonas paucimobilis對(duì)50 mg/L CV的最高脫色率可達(dá)71.29%[11]。與以往報(bào)道相比而言，本研究中菌株CV-b脫色能力較強(qiáng)，且pH適應(yīng)性強(qiáng)，應(yīng)用前景較為廣闊。

2.4菌株CV-b對(duì)CV脫色前后的全波長(zhǎng)掃描圖譜

前人研究表明，細(xì)菌對(duì)染料的脫色原因或是由生物降解引起，或是由生物吸附或富集引起。若經(jīng)脫色后，染料的特征吸收峰完全消失且產(chǎn)生新的產(chǎn)物吸收峰，則脫色是由生物降解引起；而若經(jīng)脫色后，染料全波長(zhǎng)掃描圖譜中的吸收峰相應(yīng)降低，但并不產(chǎn)生新的吸收峰，則脫色是由生物富集或吸附引起[14-15]。CV脫色前后的全波長(zhǎng)掃描圖譜如圖7所示。結(jié)果顯示，經(jīng)菌株CV-b脫色后，CV的特征吸收峰（λmax=580 nm）降低，且在紫外光譜區(qū)有新的產(chǎn)物吸收峰產(chǎn)生，因此，該菌株對(duì)CV的脫色主要由生物降解引起。

3結(jié)論

本研究從浙江溫州分離篩選到一株CV高效降解菌株CV-b，經(jīng)鑒定屬于腸桿菌屬（Enterabacter sp.）。該菌株對(duì)CV進(jìn)行脫色的pH適應(yīng)性較強(qiáng)，脫色過(guò)程中對(duì)碳氮源的依賴(lài)性不高，且多數(shù)供試金屬離子對(duì)其脫色都沒(méi)有顯著的抑制效應(yīng)，說(shuō)明其實(shí)際應(yīng)用潛力較大。另外，該菌株對(duì)CV脫色的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以很好地用對(duì)數(shù)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，經(jīng)脫色前后的全波長(zhǎng)掃描分析顯示該菌株對(duì)CV的脫色可能是由生物降解引起的。進(jìn)一步的研究將圍繞該菌株對(duì)CV的降解機(jī)理和實(shí)際應(yīng)用展開(kāi)更加深入的探索。

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