棘孢木霉對水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌生物防治的研究

陳立華　金秋　牛明　張營　邵孝侯　翟亞明

摘要：為了檢測棘孢木霉T12對立枯絲核菌的生防效果，測定了T12對立枯絲核菌RS02菌株競爭性抑制作用，T12揮發(fā)性代謝物對RSO2菌核萌發(fā)和菌絲生長的影響，T12的發(fā)酵液對tlS02菌核萌發(fā)、菌絲干質(zhì)量和侵染相關(guān)酶活力的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)4d的T12通過空間競爭對RSO2生長產(chǎn)生抑制，抑制率達(dá)78.7%；T12產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對菌核萌發(fā)和菌絲生長抑制率分別為10.3%、12.2%；大于10%濃度T12發(fā)酵液對菌核萌發(fā)、菌絲干質(zhì)量均表現(xiàn)出顯著或明顯的抑制效果，50%濃度發(fā)酵液對菌核萌發(fā)、菌絲干質(zhì)量的抑制率分別為65.7%、88.2%；培養(yǎng)5d，10%、30%、50%濃度發(fā)酵液處理的tlS02纖維素酶活力分別降低了17.4%、55.0%、76.8%，果膠酶活力分別降低了21.8%、53.9、69.5%。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，棘孢木霉T12能夠顯著抑制立枯絲核菌的生長并降低其侵染能力。

關(guān)鍵詞：立枯絲核菌；菌核；棘孢木霉；生物防治

中圖分類號：S435.111.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0115-03

水稻紋枯病是水稻的重要病害，病原菌立枯絲核菌（Rhi-zoctonia solania Kahn）能夠在土壤中存活數(shù)年，菌核是其主要的侵染源。水稻秸稈還田為紋枯病的發(fā)生提供了大量的病源，同時(shí)紋枯病病菌對特效藥井岡霉素抗性逐年增加，因此迫切須要尋找新的控制水稻紋枯病的方法。棘孢木霉Trichodermaasperellum12菌株是筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離的對水稻紋枯病具有生防效果的微生物菌株，由于針對棘孢木霉生防水稻紋枯病的報(bào)道較少，因此本研究針對棘孢木霉T.asperellum12菌株對立枯絲核菌生長和侵染能力的影響開展相關(guān)研究。

1.材料與方法

1.1供試菌株與試驗(yàn)材料

供試的棘孢木霉Trichodermaasperellum12（T12）菌株從江蘇省鹽城市的灘涂土壤中分離，通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，于4℃保存；水稻紋枯病Rhizoctonia solaniaO2（RS02）菌株由河海大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境研究所提供，通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，于4℃保存。水稻品種選用武運(yùn)粳21號，由江蘇中江種業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2生防菌株T12菌核和發(fā)酵液的制備

將RS02接種到PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)14d，用無菌鑷子捏取菌核放置在無菌濾紙上保存?zhèn)溆?。取在PDA上培養(yǎng)3d的T12菌落邊緣菌餅3塊，接種到放置200mL液體PDA培養(yǎng)液的500mL三角瓶中，于28qC、120r/rain培養(yǎng)96h。用無菌棉花和O.45um無菌濾器過濾發(fā)酵液，將獲得的無菌T12發(fā)酵液于4℃保藏備用。

1.3生防菌T12對RS02的競爭抑制作用

取在PDA上培養(yǎng)3d的T12、RS02菌落邊緣的菌餅（直徑0.5cm），同時(shí)接種到PDA培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)，菌餅之間的距離2cm；以只接種RS02菌餅的培養(yǎng)皿為對照，于28℃培養(yǎng)。每天拍照，通過Photoshop軟件測定菌落形成的不規(guī)則圖形面積，研究T12對RS02生長的影響。

1.4生防菌T12揮發(fā)性物質(zhì)對RSO2菌核萌發(fā)和菌絲生長的影響

在PDA培養(yǎng)基中接種T12菌落邊緣的菌餅，分別于28℃培養(yǎng)0、4d。將菌核均勻地接種到水瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒扣在培養(yǎng)0、4d的T12培養(yǎng)皿上，以未接種T12的空PDA培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)皿接口處用Parafilm封口膜封口，于28℃培養(yǎng)36h，測定菌核萌發(fā)率。

在PDA培養(yǎng)基中接種T12、RS02菌落邊緣的菌餅，T12分別于28℃培養(yǎng)0、4d，將T12、RS02的2個(gè)培養(yǎng)皿倒扣，培養(yǎng)皿接口處用Parafilm封口膜封口，以沒有接種T12的培養(yǎng)皿為對照，于28℃培養(yǎng)5d，測定RS02的菌落直徑。

1.5

生防菌T12發(fā)酵液對RSO2菌核萌發(fā)的影響

用T12無菌發(fā)酵液、熔解的無菌水瓊脂培養(yǎng)基和無菌水混合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中水瓊脂培養(yǎng)基比例相同，發(fā)酵液濃度分別設(shè)為0、1%、5%、10%、20%、30%、50%，培養(yǎng)基倒入平皿后均勻地接種RS02菌核，每天測定菌核的萌發(fā)率。

1.6生防菌T12發(fā)酵液對RSO2菌絲生長的影響

將PDA液體培養(yǎng)基、T12發(fā)酵液無菌過濾液和無菌水按照比例混合成培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中的PDA比例相同，T12發(fā)酵液濃度分別設(shè)為0、1%、5%、10%、20%、30%、50%。在250mL三角瓶中放置100mE培養(yǎng)液，接種1塊RS02菌餅，于28℃、50r/rain培養(yǎng)5d。用無菌濾紙過濾培養(yǎng)液中形成的菌絲，測定菌絲質(zhì)量。

1.7生防菌T12發(fā)酵液對RS02侵染相關(guān)酶活力的影響

培養(yǎng)液按照“1.5”節(jié)的方法制備，T12發(fā)酵液濃度分別設(shè)為0、10%、30%、50%。在培養(yǎng)液中添加0.5%果膠、0.5%羧甲基纖維作為RS02產(chǎn)纖維素酶、果膠酶的培養(yǎng)基。在250mL三角瓶中裝100mE液體培養(yǎng)基，每個(gè)處理的三角瓶中接種1塊RSO2菌餅，于28℃、50r/rain培養(yǎng)6d。用高速離心機(jī)離心分離菌絲，測定上清液果膠酶、纖維素酶活力，測定菌絲干質(zhì)量。

利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的生成量。以羧甲基纖維素鈉為底物，測定纖維素酶活力，酶活力單位u定義：1h產(chǎn)生相當(dāng)于1umol葡萄糖還原物質(zhì)所需酶量為1個(gè)單位酶活。以果膠為底物測定果膠酶活力，酶活力單位u定義：1h釋放出相當(dāng)于1txmol半乳糖醛酸的還原物質(zhì)所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

2.結(jié)果與分析

2.1生防菌T12對RS02生長的抑制作用

RSO2單獨(dú)培養(yǎng)以及與T12對峙培養(yǎng)的菌落面積如圖1所示。對照處理RS02的菌絲5d即長滿平皿，與T12對峙培養(yǎng)的RS02菌落在培養(yǎng)4d基本停止生長；相較于對照處理的菌絲形成面積，對峙培養(yǎng)處理菌絲生長面積減少了78.7%；培養(yǎng)5d時(shí)，T12菌株菌絲開始覆蓋RSO2菌絲。

2.2生防菌T12揮發(fā)性物質(zhì)對RSO2菌核萌發(fā)和菌絲生長的影響

T12揮發(fā)性代謝物對RSO2菌核萌發(fā)、菌絲生長的影響見表1。T12、RSO2同時(shí)接種時(shí)，T12代謝的揮發(fā)性物質(zhì)對RSO2的菌核萌發(fā)率、菌絲生長速度影響不顯著；生長4d的T12菌株代謝物顯著抑制菌核孢子萌發(fā)、菌絲的生長，抑制率分別為10.3%、12.2%.

2.3生防菌T12發(fā)酵液對RSO2菌核萌發(fā)、菌絲干質(zhì)量的影響

由圖2可知，5%的T12發(fā)酵液對RSO2的菌核萌發(fā)幾乎沒有抑制效果，高于10%濃度的T12發(fā)酵液能夠顯著抑制菌核的萌發(fā)，50%濃度的發(fā)酵液對菌核萌發(fā)抑制率達(dá)65.7%。

不同處理對RS02菌絲干質(zhì)量的影響見圖3，可見5%發(fā)酵液處理菌絲干質(zhì)量與對照處理沒有明顯差異，其他處理菌絲干質(zhì)量均明顯低于對照處理（P<0.05）；隨著發(fā)酵液濃度的增加，菌絲干質(zhì)量越低；RS02培養(yǎng)5d時(shí)，相較于對照處理，50%發(fā)酵液處理的菌絲干質(zhì)量降低了88.2%。

2.4生防菌T12發(fā)酵液對RSO2侵染性酶活力的影響

RSO2培養(yǎng)過程中單位菌絲質(zhì)量對應(yīng)的酶活力如圖4所示，可見各處理培養(yǎng)5d都能夠檢測到酶活力。結(jié)果顯示，10%、30%、50%濃度的T12發(fā)酵液均能夠抑制RS02產(chǎn)酶，單位菌絲質(zhì)量酶活力明顯降低。培養(yǎng)5d時(shí)，相較于對照處理，10%、30%、50%濃度發(fā)酵液處理的纖維素酶活力分別降低了17.4%、55.O%、76.8%，果膠酶活力分別降低了21.8%、53.9%、69.5%。

3.討論

試驗(yàn)顯示，棘孢木霉能夠通過生長競爭減小立枯絲核菌的生存空間，這是實(shí)現(xiàn)對立枯絲核菌有效防控的途徑之一。木霉屬真菌能夠代謝數(shù)十種具有抗生作用的化學(xué)物質(zhì)，其中部分化學(xué)物質(zhì)是具有揮發(fā)_性的小分子，棘孢木霉對培養(yǎng)皿上立枯絲核菌菌核萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用證明，T12菌株也能夠代謝具有抑制立枯絲核菌作用的代謝物。與立枯絲核菌同時(shí)接種的棘孢木霉沒有表現(xiàn)出對菌核萌發(fā)和菌絲生長的抑制，表明T12菌株的代謝物主要是成熟期產(chǎn)生。木霉菌的發(fā)酵液含有木霉產(chǎn)生的各種代謝物，試驗(yàn)顯示10%以上濃度發(fā)酵液均顯著地抑制立枯絲核菌菌核的萌發(fā)和菌絲的生長，這與木霉屬真菌生防效果的報(bào)道一致。木霉能夠通過競爭、產(chǎn)生拮抗物質(zhì)等手段抑制病原菌，但是關(guān)于木霉代謝物對立枯絲核菌侵染能力的影響報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，棘孢木霉T12的代謝物能夠顯著降低立枯絲核菌單位質(zhì)量菌絲產(chǎn)生的纖維素酶和果膠酶活力，表明棘孢木霉代謝物能夠顯著降低立枯絲核菌的侵染能力。棘孢木霉抑制立枯絲核菌的繁殖和侵染能力的研究，對于進(jìn)一步開發(fā)防效更佳的生防產(chǎn)品具有十分重要的理論意義。