一種可快速感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞的理論設(shè)計(jì)方案

張英昊

【摘 要】本文利用了兩類可對(duì)細(xì)胞所受機(jī)械力進(jìn)行響應(yīng)并介導(dǎo)鈣離子從細(xì)胞外流入胞質(zhì)的鈣離子通道，從理論上設(shè)計(jì)一種可響應(yīng)所受機(jī)械力并迅速將機(jī)械力轉(zhuǎn)換成適當(dāng)頻率和強(qiáng)度的熒光信號(hào)的傳感器細(xì)胞?；诖朔N理論基礎(chǔ)，研究了胞質(zhì)鈣離子異常升高誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的兩條信號(hào)通路?？梢郧玫突蚯贸}凋亡途徑中的相關(guān)分子，抑制機(jī)械力刺激產(chǎn)生的鈣離子內(nèi)流誘發(fā)的凋亡作用，從而可以使傳感器細(xì)胞穩(wěn)定傳代。

【關(guān)鍵詞】機(jī)械力；傳感器；細(xì)胞；融合蛋白

生物發(fā)酵工程中最常用的工程細(xì)胞是各種細(xì)菌，放線菌，真菌，酵母等微生物。但是生產(chǎn)一些具有較多轉(zhuǎn)錄后修飾的代謝物質(zhì)，如干擾素，各種細(xì)胞因子，糖蛋白，激素等，則不能使用微生物，因?yàn)槲⑸锶狈ο嚓P(guān)的修飾功能，生產(chǎn)出的物質(zhì)往往沒(méi)有活性。因此必須使用動(dòng)物細(xì)胞。而動(dòng)物細(xì)胞由于對(duì)環(huán)境比較敏感，比較難在大型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。而難以在反應(yīng)器中培養(yǎng)的一個(gè)原因是缺乏能直接反映細(xì)胞生理狀態(tài)的參數(shù)的檢測(cè)。眾所周知，生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)參數(shù)是溫度，ph，融氧，以及攪拌器轉(zhuǎn)速。但是以這些有限的物理、化學(xué)參數(shù)來(lái)對(duì)應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜而眾多的生理狀態(tài)，顯然是無(wú)法精確反應(yīng)實(shí)際情況的，尤其是對(duì)環(huán)境比較敏感的動(dòng)物細(xì)胞，往往是當(dāng)細(xì)胞中眾多的實(shí)際生理狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生了劇烈變化，使細(xì)胞生長(zhǎng)不佳甚至大量死亡后，上述的物理，化學(xué)參數(shù)才會(huì)有變化。因此，發(fā)酵中僅靠參數(shù)本身往往不能精確判斷發(fā)酵狀態(tài)，而是要依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)。

為了能夠解決這個(gè)問(wèn)題，筆者考慮設(shè)計(jì)一種起傳感器作用的細(xì)胞，它與用于合成代謝物質(zhì)的細(xì)胞一同在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，享受相同的環(huán)境。但是這種傳感器細(xì)胞是經(jīng)過(guò)改造的，它們能夠?qū)⒂捎谕饨绛h(huán)境變化而導(dǎo)致自身內(nèi)部發(fā)生改變的生理信號(hào)，直接轉(zhuǎn)化成可被檢測(cè)裝置感受的特定的物理或化學(xué)信號(hào)，為生物反應(yīng)器上相應(yīng)的控制軟件提供精確信息，從而對(duì)影響細(xì)胞生理狀態(tài)的微環(huán)境進(jìn)行精確檢測(cè)，并利用即時(shí)的反饋調(diào)節(jié)對(duì)生物反應(yīng)器參數(shù)進(jìn)行精確控制。

而本論文研究的是機(jī)械力對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的影響。由于動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，對(duì)機(jī)械力是非常敏感的。然而動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝物的合成都依賴氧氣，在生物反應(yīng)器中為了實(shí)現(xiàn)供氧，必須依賴于培養(yǎng)基的不斷流動(dòng)，翻滾，攪拌，這往往會(huì)產(chǎn)生變化劇烈的剪切力，損害細(xì)胞。因此，供氧和對(duì)剪切力的控制是一對(duì)矛盾體，必須平衡考慮。如果能培養(yǎng)出一種能感受所受機(jī)械力以及機(jī)械力對(duì)自身生理狀態(tài)的影響，并迅速將其轉(zhuǎn)變成特定頻率的光信號(hào)的傳感器細(xì)胞，必然對(duì)供氧和受力的控制這一過(guò)程提供很大幫助。

綜上所述，本論文根據(jù)已有的研究?jī)?nèi)容，從理論上設(shè)計(jì)一種滿足如上要求的，可感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞，并提出每一步驟中筆者能想到的可能的處理方法。

1 鈣離子通道感受機(jī)械力的機(jī)制研究

哺乳動(dòng)物體內(nèi)在生理?xiàng)l件下有很多種感受機(jī)械力的途徑，典型如細(xì)胞粘附與胞外基質(zhì)，其粘附產(chǎn)生的力調(diào)控細(xì)胞的分化與凋亡；血管內(nèi)皮細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附，當(dāng)血液流速過(guò)快或血管腔過(guò)窄時(shí)（即高血壓狀態(tài)），內(nèi)皮細(xì)胞可感受力的狀態(tài)，從而促使合成舒張血管的NO前列腺素等物質(zhì)[1]。經(jīng)過(guò)大量研究，人們公認(rèn)這些能感受機(jī)械力的細(xì)胞表面有能夠介導(dǎo)胞外鈣離子內(nèi)流的trp家族離子通道，這些鈣離子通道介導(dǎo)了機(jī)械刺激時(shí)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高。但是，需要進(jìn)一步研究trp家族感受機(jī)械力的具體機(jī)制。

研究表明，用含有RGD的磁珠處理細(xì)胞，再加磁場(chǎng)，使磁力作用于整合素上，發(fā)現(xiàn)力作用于整合素上時(shí)細(xì)胞膜顯示出了很大的剛性，即抵抗形變，同時(shí)細(xì)胞核的形狀發(fā)生了改變；相對(duì)的，用磁珠偶聯(lián)抗原肽，再加磁場(chǎng)，使力作用于MHC時(shí)，細(xì)胞膜顯示出了柔性，而且細(xì)胞核的形狀未發(fā)生改變。他們認(rèn)為機(jī)械力通過(guò)整合素，傳給了在胞內(nèi)與整合素相連的細(xì)胞骨架，再由細(xì)胞骨架傳遞給細(xì)胞核，從而引起細(xì)胞核形狀變化以及調(diào)控基因的表達(dá)。而MHC由于沒(méi)有與細(xì)胞骨架相連，故受力時(shí)細(xì)胞膜顯示出了柔性。同時(shí)，機(jī)械力刺激胞外基質(zhì)ECM，產(chǎn)生與直接力刺激整合素相同的效果。這些研究闡明了機(jī)械力傳導(dǎo)的一種基本模式，即：

機(jī)械力刺激——ECM——整合素——細(xì)胞骨架——調(diào)控生理狀態(tài)

另外一些研究顯示，用機(jī)械力刺激間充質(zhì)干細(xì)胞（刺激方式為使用光鑷為偶聯(lián)在整合素上的小珠施加力），會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的明顯升高。胞質(zhì)升高的鈣離子有兩個(gè)來(lái)源，一個(gè)是從胞外流入的，一個(gè)是從胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流出而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的（在胞外無(wú)鈣的環(huán)境中，向細(xì)胞處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道抑制劑，發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)械力刺激不會(huì)引起胞質(zhì)鈣離子上升）。該研究組發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞膜上的介導(dǎo)胞外鈣離子流入胞質(zhì)的是trp家族離子通道trpm7。他們研究了細(xì)胞骨架扮演的作用：在無(wú)IP3時(shí)，在胞外無(wú)鈣環(huán)境中，用細(xì)胞骨架解聚劑處理，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)法釋放鈣離子到胞質(zhì)；而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道，在胞外有鈣環(huán)境中，解聚細(xì)胞骨架，發(fā)現(xiàn)胞外鈣離子也無(wú)法流入。這些研究說(shuō)明了trpm7和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3receptor鈣通道對(duì)機(jī)械力的響應(yīng)機(jī)制正式通過(guò)整合素和細(xì)胞骨架作用的。事實(shí)上，另有文獻(xiàn)表明IP3r是直接與細(xì)胞骨架相連的。他們研究了trpm7和IP3r響應(yīng)機(jī)械刺激所需的時(shí)間：在機(jī)械刺激細(xì)胞上的整合素后，胞外鈣離子流入胞內(nèi)的平均時(shí)間是機(jī)械刺激后20秒，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子的平均時(shí)間是機(jī)械刺激后100秒。對(duì)于這一反應(yīng)時(shí)間的差異，該研究小組認(rèn)為是機(jī)械力沿著細(xì)胞骨架向細(xì)胞深處的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞時(shí)，細(xì)胞骨架要通過(guò)一些方式重構(gòu)來(lái)積累足夠強(qiáng)度的力學(xué)信號(hào)，這導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子延遲釋放。

綜上，細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的感受可分為ECM整合素、細(xì)胞骨架依賴性的胞質(zhì)鈣離子上升和非依賴型的胞質(zhì)鈣離子上升。ECM依賴性的機(jī)械力傳導(dǎo)機(jī)制可制作傳感器細(xì)胞用于對(duì)錨定依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如作為血管內(nèi)皮細(xì)胞生產(chǎn)前列腺素這一生產(chǎn)體系的傳感器細(xì)胞，大致的策略就是適當(dāng)調(diào)整整合素和胞外基質(zhì)和trpm7離子通道的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)鈣離子濃度對(duì)機(jī)械力刺激的最佳響應(yīng)。不過(guò)由于胞內(nèi)鈣離子的上升分別來(lái)自胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，響應(yīng)速度較慢且與細(xì)胞膜流入鈣離子的響應(yīng)時(shí)間差距較大（一個(gè)100秒一個(gè)20秒），所以從鈣離子信號(hào)即時(shí)性和整齊性的角度考慮，可以敲除或下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3r鈣離子通道。而ECM非依賴性的Yvc1p鈣離子通道，可用于可懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)體系，比如培養(yǎng)巨噬細(xì)胞生產(chǎn)干擾素以及白介素等細(xì)胞因子。

2 由胞質(zhì)鈣離子變化的生理信號(hào)向可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)化

生物體中可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)最容易想到的就是熒光蛋白。比較容易想到的一類生理狀態(tài)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)的方式是通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程調(diào)控?zé)晒獾鞍椎谋磉_(dá)量的變化，從而改變亮度。這些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的途徑研究成果非常多，比如camp-creb途徑、CaM CaN NFAT途徑、Nf-kapa b途徑等等。但是改變熒光蛋白的表達(dá)量必須走轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，而這個(gè)過(guò)程無(wú)疑是很耗費(fèi)時(shí)間的，通常情況下，在多種信號(hào)通路中，適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激引起的某種分子的表達(dá)量的變化，至少也要五到六個(gè)小時(shí)才會(huì)有明顯差異。因此基因表達(dá)量調(diào)控的方式雖然適合開(kāi)發(fā)藥物，但是與細(xì)胞傳感器即時(shí)性的要求是不符合的。故鈣離子向光信號(hào)轉(zhuǎn)化，只能依賴化學(xué)反應(yīng)。

鈣離子成像，最常用的是一種叫fura-am的染料，該染料是脂溶性的，能透過(guò)細(xì)胞膜，然后被酯酶分解形成不透膜的fura留于胞內(nèi)，與鈣離子定量結(jié)合，發(fā)射熒光。但是這種染料必須人為加入細(xì)胞，而無(wú)法讓細(xì)胞自己產(chǎn)生。而在實(shí)際的生產(chǎn)系統(tǒng)中是不可能嚴(yán)格區(qū)分生產(chǎn)細(xì)胞和傳感細(xì)胞的，若統(tǒng)一加入染料，由生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣熒光，可以想象，會(huì)是一種強(qiáng)烈的背景干擾。因此，最好還是只對(duì)傳感細(xì)胞進(jìn)行改造。

根據(jù)前人的研究結(jié)果，可以使用一種融合的熒光蛋白。該熒光蛋白利用了熒光共振轉(zhuǎn)移（FRET）原理。事先已大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在為結(jié)合與結(jié)合鈣離子時(shí)會(huì)擁有不同的構(gòu)象，在未結(jié)合鈣離子時(shí)發(fā)青光，結(jié)合時(shí)發(fā)紅光。根據(jù)這兩種頻率光的強(qiáng)度的比值，可以精確探測(cè)出胞內(nèi)鈣離子的濃度。而且這種探測(cè)是幾乎即時(shí)的，因?yàn)椴簧婕稗D(zhuǎn)錄翻譯，僅僅是由于鈣離子出現(xiàn)導(dǎo)致的構(gòu)象變化。

3 排除胞質(zhì)鈣離子濃度上升介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是一種相對(duì)比較溫和的過(guò)程，不發(fā)生炎癥反應(yīng)[2]。細(xì)胞凋亡上游的影響因素很多，涉及多種不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。但它們有共同的下游途徑，即激活bax/bak蛋白二聚化，定位于線粒體膜，使線粒體膜通透性喪失，內(nèi)容物流出；然后凋亡又分為caspase 依賴和非依賴途徑，其中依賴途徑研究較清楚，即線粒體釋放的細(xì)胞色素c和apaf-1，與胞質(zhì)中caspase9，形成復(fù)合體，并激活caspase3，誘導(dǎo)凋亡。而非凋亡途徑則由線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)因子（aif）引發(fā)，具體機(jī)制尚不清楚。凋亡的最終途徑是染色體斷裂成小碎片，與細(xì)胞器聚集在一起后，被表達(dá)有磷脂酰絲氨酸作吞噬信號(hào)的質(zhì)膜包裹成小球，被臨近細(xì)胞識(shí)別吞噬。由于細(xì)胞凋亡總伴隨著凋亡小體形成，因此可以用TUNNEL實(shí)驗(yàn)，來(lái)定量化反應(yīng)細(xì)胞凋亡程度，這也是下面的文獻(xiàn)中的凋亡程度的評(píng)價(jià)方法。

而根據(jù)已有的研究[3]，胞質(zhì)鈣離子的異常升高，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。而我們的傳感器細(xì)胞感受機(jī)械力的原理就是胞質(zhì)鈣離子升高，因此必須對(duì)細(xì)胞感受鈣離子的凋亡通路進(jìn)行研究，并削弱這一通路。在正常細(xì)胞中，由腫瘤壞死因子結(jié)合死亡受體，激活caspas8，從而切割bid為t-bid（truncated bid），t-bid與線粒體上的bak/bax結(jié)合，在線粒體上形成孔道，促使線粒體內(nèi)容物釋放誘發(fā)凋亡。而在胞質(zhì)鈣離子升高時(shí)，鈣離子會(huì)激活鈣蛋白酶calpain，calpain可在bid的gly70和arg71之間切割形成t-bid（這里使用了gst-pull down方法，分離切割后的片段，在進(jìn)行末端測(cè)序得到切割位點(diǎn)），進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡。

而另一條鈣離子介導(dǎo)的凋亡通路也被發(fā)現(xiàn)，即正常時(shí)磷酸化的Bad蛋白與14-3-3蛋白結(jié)合維持細(xì)胞存活狀態(tài)，這種bad的磷酸化是由多種上游信號(hào)通路介導(dǎo)的其中的兩個(gè)例子是mapk家族的mekk和蛋白激酶B（即akt）[4]；鈣離子激活鈣調(diào)蛋白磷酸酶（CaN），使其去磷酸化，與14-3-3蛋白解離；解離后Bad與Bcl2-bak復(fù)合體作用，置換出游離的bak；游離的bak二聚化，暴露bak的N末端（該末端可作為抗原表位，能夠以熒光抗體的方法衡量bak的促凋亡活化程度），然后插入線粒體膜，形成孔道釋放內(nèi)容物，誘發(fā)凋亡。用calpain的抑制劑處理細(xì)胞，在測(cè)量二聚化的bax的量，發(fā)現(xiàn)bax的表達(dá)量不受影響，這進(jìn)一步證實(shí)了鈣離子引發(fā)的bid被切割誘發(fā)凋亡和bad被磷酸化誘導(dǎo)的凋亡分屬兩條不同的途徑。然而，后來(lái)又有研究表明，在缺失bak/bax，只有t-bid的存在不會(huì)使線粒體通透性喪失，而只有bak/bax沒(méi)有t-bid時(shí)bax能轉(zhuǎn)位與線粒體但沒(méi)有通透線粒體的作用，推測(cè)與bax同源的bak也有相同的效果。因此t-bid是bax/bak促凋亡的激活劑[4]。4 結(jié)論

根據(jù)上述文獻(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié)，可得出鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的通路如圖1：

因此，如果要制作傳感器細(xì)胞，可以考慮敲除bid 敲除bax/bak calpain CaN，或者可以用低效率的啟動(dòng)子下調(diào)這些基因的表達(dá)。

如上便是可感受機(jī)械力的傳感器細(xì)胞的簡(jiǎn)要設(shè)計(jì)方案。

相信隨著生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及對(duì)生物發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)要求不斷提高，適應(yīng)于動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵條件的精確控制的傳感器細(xì)胞會(huì)大有用武之地。在必要的時(shí)候，可以考慮引入一些特定的支架分子，它們能夠?qū)⒓?xì)胞感受缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的上游信號(hào)，不通過(guò)經(jīng)典的調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯途徑，而是將其引向一種人為設(shè)計(jì)的或者與經(jīng)典途徑不相干的，可快速反應(yīng)的新途徑，即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)通路的嫁接和改造。當(dāng)然，研發(fā)能夠快速感應(yīng)生理信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟蓹z測(cè)的物理化學(xué)信號(hào)的生物傳感分子（比如本文中使用的熒光探針）也是必不可少的。

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[責(zé)任編輯：侯天宇]