光譜法研究7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸與蛋白質(zhì)相互作用

謝飛燕，李險(xiǎn)峰，溫燕君

（惠州學(xué)院化學(xué)工程系，廣東 惠州 516007）

0 引言

白蛋白是血槳中最豐富的蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)起著重要的儲存和輸運(yùn)作用［1].因此對白蛋白的分析研究具有十分重要的意義.熒光法具有高靈敏度、高選擇性、在線分析、容易操作和成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于蛋白質(zhì)的檢測［2-5].有關(guān)血清白蛋白與各種熒光探針之間的相互作用的研究是目前生命科學(xué)、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中共同關(guān)注的課題［6-8].喹啉類的主體被設(shè)計(jì)運(yùn)用于蛋白質(zhì)的測定較少，俞英等［9]報(bào)道了8-羥基喹啉-5-磺酸-7-偶氮衍生物與牛血清白蛋白（BSA）在酸性溶液中的結(jié)合反應(yīng)，因此我們認(rèn)為8-羥基喹啉類化合物可應(yīng)用于生物體系如蛋白質(zhì)和DNA等的研究.據(jù)此設(shè)計(jì)合成了7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸，與蛋白質(zhì)的相互作用研究尚少見報(bào)道.本文利用熒光光譜求出了7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸與白蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)，提出了模擬人體pH條件下兩者存在的模式，利用Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論確定了7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸在白蛋白上的結(jié)合位置和能量轉(zhuǎn)移效率，利用7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸對白蛋白的熒光猝滅，對作用機(jī)理作了初步探討.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑 7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸（主體HOST）結(jié)構(gòu)圖如圖1，用二次蒸餾水配制，儲備液濃度為1.0×10-4mol/L.牛血清白蛋白（BSA）（武漢亞法生物技術(shù)有限公司）用水制成1.0×10-4mol/L的儲備液：準(zhǔn)確稱量0.068 g的BSA，用水溶解后再轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容后，放置在1～4℃的冰箱中保存.同樣配置1.0×10-4mol/L的HSA（浙江海康生物制品有限公司）儲備液.緩沖溶液為0.05mol/L pH=7.40的Tris-HCl（含CNaCl=0.05mol/L）.所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.1.2 主要儀器 F-4500熒光光度計(jì)（日本日立公司）；UV-2501PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；PHS-3C精密PH（上海偉業(yè)儀器廠）.

圖1 主體的結(jié)構(gòu)圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法在5mL刻度試管中依次加入主體溶液和一定量的BSA（HSA）溶液，用緩沖溶液稀釋至刻度，掃描其熒光光譜圖及紫外-可見光譜圖.在蛋白質(zhì)分子對主體的熒光增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中以320 nm為激發(fā)波長，在335～610 nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜.而在蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中，選擇280 nm作為激發(fā)波長掃描熒光譜圖.熒光偏振光譜以320 nrn激發(fā)，檢測400 nm處的熒光偏振強(qiáng)度.在所有的熒光檢測中，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度都采用5 nm，掃描速度為240 nm/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸在蛋白質(zhì)測定中的應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)條件下，主體在400 nm處有弱熒光，隨著BSA（HSA）加入，主體的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，主體測定蛋白質(zhì)的線性范圍和檢測限見表1.在圖2中，隨著HSA加入主體峰位有較弱的藍(lán)移，說明疏水環(huán)境的增加可抑制發(fā)光分子的非輻射躍遷，使熒光增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著熒光光譜的藍(lán)移.

表1 主體測定蛋白質(zhì)的相關(guān)參數(shù)

圖2 激發(fā)波長為320 nm，BSA和HSA分別存在時(shí)主體（1.0×10-6 mol·L-1）的熒光光譜變化

2.2 主體對BSA和HSA熒光光譜的猝滅由于蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基，能在280 nm激發(fā)光的照射下于340 nm附近發(fā)射較強(qiáng)的熒光，其發(fā)光常被其他外來分子所猝滅，因此蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光常用于研究熒光探針與蛋白質(zhì)間相互作用機(jī)理.熒光猝滅分為兩類即動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程、如能量轉(zhuǎn)移過程或電子轉(zhuǎn)移過程.靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生了配合反應(yīng)，生成了不發(fā)熒光的配合物.圖3為不同濃度的主體存在時(shí)BSA熒光光譜的變化，由該圖可知蛋白質(zhì)的熒光被猝滅HSA具有與BSA相似的光譜響應(yīng).

圖3 激發(fā)波長為280 nm、不同濃度主體存在時(shí)BSA和HSA（2.0×10-6 mol·L-1）熒光光譜的變化

為進(jìn)一步證實(shí)此猝滅過程、將此過程按動態(tài)過程處理，其熒光猝滅方程為［10]：

式中Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為猝滅體不存在時(shí)熒光分子平均壽命，［Q]為猝滅劑濃度，而KSV=Kqτ0、Kq=KSV/τ0、由于生物大分子熒光壽命約為10-8s［11]，故可由猝滅曲線斜率求得猝滅速率常數(shù)，如表2所示.而各類猝滅劑對生物分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010·L·mol-1s-1［12]、據(jù)表2可知主體對BSA和HSA猝滅過程速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于擴(kuò)散控制的Kq、所以進(jìn)一步證明主體對BSA和HSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅.

表2 白蛋白與主體間相互作用的熒光猝滅常數(shù)

2.3 主體與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)（Ka）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）的計(jì)算對于靜態(tài)猝滅過程，可按如下公式表述［13]：

以lg（F0-F）/F對lg［Q]作圖可得一直線，由該直線的斜率和截距求得主體與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果如表3所示.

表3 主體與蛋白質(zhì)間結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.4 主體與BSA（HSA）間的能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是指一對合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體和一個(gè)能量受體，它們之間存在偶極-偶極的相互作用，激發(fā)供體分子的光子能量可以被傳遞至受體分子，使受體分子發(fā)射熒光.供體和受體之間在一定的距離范圍內(nèi)，以供體的發(fā)光激發(fā)，供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低得多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng).通過供受體間的能量轉(zhuǎn)移檢測供受體的距離與躍遷偶極的相對取向等值，能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體間距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0相關(guān)［14-15]：

式中F0為無主體存在時(shí)白蛋白的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入主體后白蛋白的熒光強(qiáng)度，R0是E=50%時(shí)的臨界距離［16]：

式中，K2為偶極空間取向因子，N為介質(zhì)的折射指數(shù)，Φ為供體的光量子效率，J為供體（蛋白質(zhì)）熒光發(fā)射光譜與受體（主體）吸收光譜間的光譜重疊積分，可表示為：

其中F（λ）為熒光供體在波長λ處的熒光強(qiáng)度，ε（λ）則為受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù).

圖4為BSA（HAS）的熒光光譜與主體的吸收光譜的重疊圖，兩者的濃度相同.將圖中光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和，通過（5）式求得光譜的重疊積分分別為JBSA=6.123×10-15cm3·mol-1·L-1、JHSA=5.980×10-15cm3·mol-1·L-1，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，取向因子取熒光給體-受體各向隨機(jī)分布的平均值K2=2/3，BSA、HSA中色氨酸殘基熒光量子效率Φ=0.15，折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值N=1.36［17]，將上述數(shù)值代入（4）式求得：R0=2.32 nm（BSA）和R0=2.31 nm（HSA），再由式（3）求得能量轉(zhuǎn)移效率EBSA=0.038和EHSA=0.161.最后由R0、E按（3）式求出BSA、HSA中色氨酸殘基與主體間的作用距離分別為：rBSA=3.98 nm、rHSA=3.04 nm.

圖4 BSA（a）和HSA（b）（2.0 ×10-6 mol·L-1）熒光光譜與主體（2.0 ×10-6 mol·L-1）吸收光譜的重疊圖

2.5 主體對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響同步熒光光譜已被廣泛用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析.由Δλ=15 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的光譜特性，而Δλ=60 nm同步熒光僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光.因殘基的最大發(fā)射波長與其所處的環(huán)境有關(guān)，故由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化［18].

圖5（a）和（b）分別為蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸殘基的熒光光譜.由圖易見，隨著主體的濃度增大，色氨酸殘基的最大發(fā)射波長保持不變，而酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長藍(lán)移，表明酪氨酸殘基所在處環(huán)境的疏水性增加，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化.

2.6 主體與蛋白質(zhì)的熒光偏振實(shí)驗(yàn)偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān).在粘度小的溶劑（如水）中，由于小分子旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散很快，其熒光偏振一般很小，而當(dāng)小分子主體與蛋白質(zhì)作用時(shí)，其轉(zhuǎn)動受阻，導(dǎo)致小分子轉(zhuǎn)動速度變慢，因而熒光偏振會隨之變大，如圖6所示.

圖5 主體對蛋白質(zhì)（2.0×10-6 mol·L-1）同步熒光光譜圖

2.7 共存物質(zhì)對測定7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸的干擾在實(shí)驗(yàn)條件下，1.0×10-6mol/L的主體和2.0×10-6mol/L的HSA加入干擾物質(zhì)進(jìn)行混合，研究一些可能的共存離子如蛋氨酸、葡萄糖和尿素等物質(zhì)的干擾.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4.

3 結(jié)論

應(yīng)用紫外光譜法和熒光光譜法研究了7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸與蛋白質(zhì)的作用.實(shí)驗(yàn)表明、其熒光強(qiáng)度隨著蛋白質(zhì)的加入明顯增強(qiáng)，據(jù)此建立了測定微量蛋白質(zhì)的新方法.7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸對牛血清白蛋白和人血清白蛋白的熒光產(chǎn)生猝滅，且猝滅過程是由形成化合物而引起的靜態(tài)猝滅.根據(jù)Forster理論，計(jì)算了7-［（8-喹啉）偶氮]-8-羥基喹啉-5-磺酸與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的作用距離，為研究和了解生物大分子與小分子作用的化學(xué)本質(zhì)提供了依據(jù).

圖6 主體（3.0×10-6 mol·L-1）BSA（HSA）存在時(shí)偏振熒光變化、G=1.281

表4 共存離子的影響

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