鹽酸川芎嗪與牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金屬離子的影響

劉里，成飛翔

（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011）

血清白蛋白是一類重要的運(yùn)輸性蛋白，在生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中含量非常豐富，幾乎占血清蛋白的60%［1].近年來采用光譜研究藥物與血清白蛋白的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，這對(duì)于了解生命過程、藥物作用機(jī)制及藥物分子設(shè)計(jì)等都具有重要作用［1-3].因結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白（簡(jiǎn)稱HSA）的相似性，牛血清白蛋白（簡(jiǎn)稱BSA）被廣泛地運(yùn)用于與藥物結(jié)合作用的研究［1].鹽酸川芎嗪（ligustrazine hydrochloride，簡(jiǎn)稱LH），是傳統(tǒng)的活血化淤中藥里的代表藥材川芎中的主要活性成分，是治療用于缺血性腦血管疾?。ㄈ缒X供血不足、腦血栓形成、腦栓塞）的常用藥［4-6].馬貴斌等［5]和張愛平等［6]研究了LH與HSA的相互作用，但主要集中在在兩個(gè)溫度下猝滅機(jī)理的判斷和熱力學(xué)研究上.而本文在優(yōu)化的條件下，從更多的方面系統(tǒng)地研究了3個(gè)不同溫度時(shí)LH與BSA的結(jié)合反應(yīng)，除了作用機(jī)理的研究，還詳細(xì)地探討了兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合部位、相互作用力類型、藥物之間的協(xié)同性、對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響以及金屬離子對(duì)LH與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響.這些研究對(duì)于闡明LH在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用具有參考意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑熒光光譜儀：F-4600，日本日立公司，狹縫寬度10.0 nm，光電倍增管負(fù)電壓為400 V；紫外-可見光譜儀：Cary 50型，美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司；精密酸度計(jì)：pHS-3C，上海虹益儀器儀表有限公司.牛血清白蛋白：上?？瑯由锛夹g(shù)有限公司，配制1.0×10-5mol/L的溶液；鹽酸川芎嗪：98%，阿拉丁?上海晶純生化科技股份有限公司，配制1.916 7×10-3mol·L-1的溶液；其他試劑都為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法依次加入2.0mL，pH=7.4，0.01mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液，1.5mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0×10-5mol·L-1），2.0mLNaCl溶液（0.5mol·L-1）和不同體積的1.9167× 10-3mol·L-1的LH溶液于10 mL比色管中，稀釋到刻度，混合均勻，在熒光儀上以最大激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm光激發(fā)得到熒光發(fā)射光譜，最大發(fā)射波長(zhǎng)λem在340 nm處.LH-BSA體系中加入0.5mL1.0×10-3mol·L-1金屬離子溶液，其他條件同上，測(cè)量熒光光譜.掃描同步熒光光譜（Δλ=15 nm和60 nm）記錄LH不存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度F0和與LH存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度F.測(cè)定物質(zhì)的摩爾濃度比為1∶1的BSA與LH溶液的紫外吸收光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化分別考察緩沖溶液種類、pH值、緩沖溶液的用量、BSA的濃度以及試劑加入順序?qū)w系的熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)選用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液2.0mL調(diào)節(jié)酸度，1.5×10-6mol/LBSA作為反應(yīng)濃度，LH→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入順序時(shí)最佳，因此實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化出來的結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量.

2.2 猝滅光譜BSA分子中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基能夠吸收270～300 nm的紫外光而發(fā)出熒光［4].圖1是固定BSA濃度，增加LH量的猝滅光譜圖.圖1中BSA峰形無明顯變化，強(qiáng)度卻明顯降低，λem略向藍(lán)移，說明LH對(duì)BSA的熒光有猝滅作用.

圖1 LH對(duì)BSA的猝滅光譜

圖2 3個(gè)不同溫度下的S-V圖

2.3 猝滅方式的研究

2.3.1 溫度對(duì)猝滅的影響 為了確認(rèn)LH對(duì)BSA的猝滅機(jī)理，實(shí)驗(yàn)用S-V公式［5-6]：F0/F=1+KSV［C]=1+Kqτ0［C]對(duì)不同溫度下熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析.式中KSV為猝滅常數(shù)；Kq為表觀速率常數(shù)，τ0為熒光體平均壽命，一般為10-8s數(shù)量級(jí)［5-6]，［C]為L(zhǎng)H的濃度.按照實(shí)驗(yàn)方法在297 K，312 K和327 K時(shí)以F0/F對(duì)［C]作圖（如圖2所示），并根據(jù)公式算出3個(gè)溫度下的KSV和Kq列于表1.表中所有溫度下的Kq值比動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)大兩個(gè)數(shù)量級(jí)，說明LH對(duì)BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅.由圖2可知，3個(gè)溫度下的S-V曲線均呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高，直線斜率即Ksv減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)理相吻合.與文獻(xiàn)［5-6]報(bào)道的LH與HSA猝滅機(jī)理一樣，文獻(xiàn)中Ksv值也是104數(shù)量級(jí).

若LH對(duì)BSA為靜態(tài)猝滅，應(yīng)符合L-B方程［7-9]：(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[C])-1式中KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù).(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線，結(jié)果見表2.從表2可以看出，3個(gè)溫度下的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.99以上，線性關(guān)系良好，其KLB值都在103數(shù)量級(jí)，表明LH與BSA由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結(jié)合力較強(qiáng).以往文獻(xiàn)中討論較少.

表1 不同溫度下LH-BSA的S-V方程及相關(guān)系數(shù)

表2 L-B線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

2.3.2 紫外吸收光譜 另一判斷猝滅機(jī)理的方法是對(duì)比藥品加入前后熒光體吸收光譜的變化，動(dòng)態(tài)猝滅僅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)而不影響熒光體的吸收光譜，而靜態(tài)猝滅時(shí)基態(tài)配合物的形成會(huì)引起熒光體吸收光譜的變化［5-9].圖2中BSA在210 nm附近有一個(gè)強(qiáng)吸收（曲線b），LH在此期間內(nèi)幾乎無吸收（曲線a）.曲線c和曲線d幾乎重合（見圖3），表明LH并沒有改變BSA的紫外吸收光譜，與前面LH對(duì)BSA的猝滅是靜態(tài)猝滅過程的判斷相一致.

圖2 LH、BSA的紫外吸收光譜a、b分別為L(zhǎng)H、BSA的吸收曲線

圖3 LH-BSA混合液的紫外吸收光譜c:LH-BSA混合液的吸收曲線，d:LH吸收曲線與BSA吸收曲線的疊加

2.4 結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n如藥物小分子與生物大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，它們之間相互作用關(guān)系符合Langmuir公式：lg［（F0-F）/F]=lgKb+nlg［C]［7-9].由lg［（F0-F）/F]對(duì)lg［C]作圖，由直線截距可得結(jié)合常數(shù)Kb，斜率可求n，計(jì)算結(jié)果見表3.

由表3可看出：297 K，n≈1，表明LH與BSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；312 K、327 K是n≈2，可形成2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，總體趨勢(shì)來看Kb也隨溫度升高而增加.從n和Kb的變化來看，溫度的變化對(duì)結(jié)合影響較大；n和Kb值都較大，溫度的提升有利于血清白蛋白攜帶著LH在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配.與文獻(xiàn)［5]中報(bào)道的298K和308 K時(shí)n分別為1.06和1.05值相近.

表3 LH-BSA的K b和n

2.5 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型當(dāng)溫度相差不大時(shí)，可以把焓變看成一個(gè)常數(shù)，由不同溫度下的Kb，可根據(jù)熱力學(xué)方程［7-9]算出反應(yīng)焓變?chǔ)、自由能ΔG和熵變?chǔ)，計(jì)算結(jié)果見表4.由表4可知，LH與BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔG＜0，ΔH＞0，ΔS＞0表明LH與BSA為自發(fā)的，吸熱反應(yīng).根據(jù)Ross等［10]總結(jié)出的規(guī)律推測(cè)，LH與BSA主要以疏水作用力相結(jié)合，與文獻(xiàn)［5]中報(bào)道的LH與HSA結(jié)合力類型相符.

表4 LH對(duì)BSA作用在不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)值

2.6 結(jié)合位置的確定大多數(shù)藥物在BSA上結(jié)合部位為亞螺旋域ⅡA（含有酪氨酸和色氨酸）和亞螺旋域ⅢA（含有酪氨酸）.為確定LH與BSA結(jié)合的具體位置采用對(duì)比λex=280 nm和λex=295 nm時(shí)的熒光光譜的方法［11-14].由圖4可知，兩種激發(fā)波長(zhǎng)下，LH與BSA的猝滅曲線是獨(dú)立的，而且猝滅程度是λem=280 nm時(shí)比λem=295 nm時(shí)的大，這一現(xiàn)象說明在LH與BSA的猝滅反應(yīng)中，色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中.進(jìn)而可以確定，LH與BSA的結(jié)合位置主要位于亞螺旋域ⅡA.以往文獻(xiàn)中少見討論LH與HSA結(jié)合位置.

圖4 λex為280 nm和295 nm時(shí)LH-BSA的熒光光譜

2.7 藥物協(xié)同作用BSA具有多重結(jié)合部位，藥物與BSA結(jié)合時(shí)，BSA各結(jié)合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用［11-14]，可用Hill方程［11-14]進(jìn)行分析：lgD/(1-D)=lgK+nHlg[C]，式中，D為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，K為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill系數(shù).在熒光實(shí)驗(yàn)中：D/(1-D)=B/(Bm-B)，其中，B=（F0-F）/F0；1/Bm是1/B對(duì)1/［C]作圖的截距.CS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5.表5表明，藥物協(xié)同性對(duì)溫度變化不是很敏感，3個(gè)溫度下的nH都略小于1，說明LH與BSA結(jié)合過程中，LH分子之間呈現(xiàn)出弱的負(fù)協(xié)同作用，即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，阻礙了后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合.以往文獻(xiàn)中少見討論LH與HSA藥物協(xié)同作用.

表5 3個(gè)溫度下體系的Hill系數(shù)n H(λ=280 nm)

2.8 LH對(duì)BSA構(gòu)象的影響B(tài)SA的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來分析，根據(jù)λem的變化來確定［8-10]其熒光猝滅主要由何種氨基酸殘基起主導(dǎo)作用，而且氨基酸殘基的λem移動(dòng)方向與其所處的疏水性也密切相關(guān)［8-10].酪氨酸殘基的特征熒光由Δλ=15 nm時(shí)測(cè)得的同步熒光光譜顯示；色氨酸殘基的特征熒光由Δλ=60 nm測(cè)得的同步熒光光譜顯示［8-10].在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下，測(cè)定LH加入BSA之后的同步熒光光譜（見圖5）.由圖可知，兩種氨基酸殘基的熒光強(qiáng)度都隨LH的不斷加入而逐漸降低，λem明顯向紫移，說明LH的加入改變了BSA的構(gòu)象，使其色氨酸和酪氨酸殘基的疏水結(jié)構(gòu)變小，導(dǎo)致肽鏈的伸展程度減弱，使得BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性減弱，疏水性增強(qiáng)［8-10].并且酪氨酸移動(dòng)得更明顯，猝滅程度也更大說明LH與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更加接近于酪氨酸殘基.LH也改變了HSA的構(gòu)象［5]，但具體結(jié)合位點(diǎn)更靠近哪個(gè)殘基未予討論.

2.9 金屬離子的影響人體內(nèi)存在著的金屬離子會(huì)參與生命過程，這些金屬元素不僅與蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合力，而且與藥物也有一定的作用，金屬元素的存在會(huì)直接影響到藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合已有報(bào)道［14-15].本文中考察Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+對(duì)LH-BSA體系Kb和n的影響，結(jié)果見表6.從表6中可明顯看出，金屬離子不同，Kb′和n也不同，其原因可能是金屬元素本身的原子結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致與BSA的結(jié)合力和結(jié)合位點(diǎn)的差異.除了Mg2+以外，其他4種離子加入后，Kb和n都增加了，即金屬離子對(duì)藥物與蛋白質(zhì)的作用產(chǎn)生了促進(jìn)作用，其中Cu2+對(duì)結(jié)合體系的影響最大.原因可能是LH與BSA結(jié)合時(shí)，金屬離子是通過橋聯(lián)作用或形成“離子架橋”［14-15]方式參與其中的，即金屬離子先與LH結(jié)合，然后再與BSA結(jié)合，這種結(jié)合促進(jìn)了LH與BSA的結(jié)合能力.Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+的加入會(huì)使LH與BSA的結(jié)合作用增大，有利于延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間，延長(zhǎng)了藥效時(shí)間.Mg2+的加入與其他4種離子所產(chǎn)生的效果相反，減小了原本的Kb和n值，說明Mg2+對(duì)LH與BSA結(jié)合產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)作用，可能是Mg2+與BSA先結(jié)合，占據(jù)了BSA的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制了BSA與藥物的結(jié)合作用，說明Mg2+對(duì)LH與BSA結(jié)合產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)作用，抑制了BSA與藥物的結(jié)合作用，縮短了LH在血液中的停留時(shí)間.LH與HSA在Mg2+存在時(shí)Kb也減小，Zn2+和Cu2+存在時(shí)Kb也增大，與本研究結(jié)果一致.

圖5 LH與BSA的同步熒光光譜圖

表6 不同金屬離子的影響

3 結(jié)論

用光譜法推斷出LH對(duì)BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，兩者靠疏水作用力相結(jié)合；通過計(jì)算求得了Kb和n值的大小，表明LH可以被BSA運(yùn)輸；兩者結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅡA中；在LH與BSA結(jié)合過程中，藥物分子之間有弱的負(fù)協(xié)同性；LH的存在誘導(dǎo)BSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化，結(jié)合位點(diǎn)更加接近于酪氨酸殘基；詳細(xì)研究了Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+對(duì)LH與BSA相互作用的影響.

［1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）［M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2012：678.

［2]薛春霞，董社英.藥物分子與血清白蛋白相互作用的研究進(jìn)展［J].廣東化工，2013，40（262）：148-149.

［3]王芳，裴明硯，唐乾，等.藥物與血清白蛋白相互作用中熒光光譜學(xué)的研究進(jìn)展［J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，3（3）：39-43.

［4]汪世龍.蛋白質(zhì)化學(xué)［M]，上海：同濟(jì)大學(xué)出版社，2012，139.

［5]馬貴斌，高飛，任斌知，等.熒光法研究藥物分子與人血清白蛋白的結(jié)合作用［J].化學(xué)學(xué)報(bào)，1995，53：1193-1197.

［6]張愛平，楊錦艷，王麗，等.川芎嗪與人血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)研究［J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（8）：965-968.

［5]Lakowicz JR.Principles of fluorescence spectroscopy［M].3rd.New York：Springer Press，2006：280.

［6]許金鉤，王尊本.熒光分析法［M].北京：科學(xué)出版社，2006：42-60.

［7]劉里，彭洪生，伏云紅.熒光光譜法研究頭孢孟多酯與牛血清白蛋白的相互作用［J].中國(guó)測(cè)試，2014，40（3）：64-67.

［8]殷磊，劉里，何志釗，等.熒光光譜法研究頭孢硫脒與牛血清白蛋白的相互作用［J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，18（19）：14-17.

［9]劉里.光譜法研究馬來酸氯苯那敏與牛血清白蛋白的相互作用［J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，50（5）：44-47，53.

［10]Ross DP，Subramantan S.The rmodynamicsof protein association reactions：forcrs cont ributing to stability［J].Biochemstry，1981，20（11）：3096-3102.

［11]劉保生，楊超，王晶，等，硫酸頭孢匹羅與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)的發(fā)光機(jī)理［J].發(fā)光學(xué)報(bào).2011，32（3）：295-296.

［12]Sulkowska A，Maciazek-Jurczyk M，Bojko B，etal.Competitive binding of phenylbutazone and colchicine to serum albumin inmultidrug therapy［J].JMol Struct，2008，881（1-3）：97-106.

［13]Bojko B，Su?kowska A，Maciaz˙ek-Jurczyk M，et al.The influence of dietary habits and pathological conditions on the binding of theophylline to bovine serum albumin［J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，52（3）：384-390.

［14]劉保生，楊超，王晶，等.頭孢匹胺鈉與牛血清白蛋白相互作用機(jī)理及共存金屬離子的影響［J].發(fā)光學(xué)報(bào)，2012，33（9）：1021.

［15]劉麗虹，方光榮，宋功武.銅離子存在下依諾沙星與牛血清白蛋白的相互作用研究［J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，26（2）：131-133.