鐵棒錘提取物對常見腸道致病菌體外抑制作用

董開忠，　傅思武，　楊世英，　米友軍，　蘇 露

（西北民族大學醫(yī)學院，甘肅　蘭州　730030）

鐵棒錘提取物對常見腸道致病菌體外抑制作用

董開忠，傅思武，楊世英，米友軍，蘇 露

（西北民族大學醫(yī)學院，甘肅蘭州730030）

目的 探索鐵棒錘提取物對腸道致病菌的體外抑制作用。方法 應(yīng)用水和醇兩種溶劑并輔助超聲波提取法，采用瓊脂擴散法測定提取物的抑菌性，并通過光譜法和倍比稀釋法測定對腸道致病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）以及最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）。結(jié)果 鐵棒錘超聲水提物抑菌圈與超聲波醇提物相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對7種腸道致病菌抑菌性隨藥物濃度的增加差異有顯著性（P＜0.01），且MIC在12.5～20 mg/mL范圍內(nèi)。結(jié)論 鐵棒錘水提取物對細菌性腸道致病菌在體外有較好的抑制作用。

藏藥；鐵棒錘；腸道致病菌；抑菌作用

藏藥鐵棒錘Aconitum pendulum Busch屬毛莨科烏頭屬草本植物，主要生長在高海拔（3 300～4 900 m）地區(qū)。是藏族習用藥之一，名為榜阿那保，具有清熱解毒，祛風除濕，消腫止痛、活血祛瘀等藥理活性［1］。主要用于風濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、黃水病，麻風，癲狂，腫瘤等疾病的治療［2］。該植物長期處于強日照、大溫差、高寒缺氧的特殊環(huán)境造就了特有的次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物往往是新藥開發(fā)的潛在先導化合物［3］。

目前國內(nèi)外對鐵棒錘的研究主要是成分分離鑒定，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析其根部的5個主要生物堿成分為12-表-歐烏頭堿、3-脫氧烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿-8-亞油酸酯和烏頭堿-8-亞油酸酯［4-5］；其中部分生物堿具有殺蟲［6］和對小鼠的毒殺活性［7］；段徑云等用鐵棒錘水提浸膏對小鼠移植瘤［S180（多形細胞性肉瘤），H22（肝細胞瘤）和S37（未分化肉瘤）］有明顯抑制作用［8］。目前對藏藥的藥理研究報道較少，尚無鐵棒錘體外抑菌作用的研究，為了探討藏藥鐵棒錘發(fā)揮藥理作用的機理，本實驗旨在探索藏藥鐵棒錘抑菌物質(zhì)提取工藝及對常見腸道致病菌的抑菌作用，明確鐵棒錘對消化道感染細菌的抑菌作用特點，為民族醫(yī)藥藏藥研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗菌種 金黃色葡萄球菌Staphylococcu aureaus（ATCC25923）、大腸埃希菌Escherichia coli（ATCC25922）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（ATCC6633）、傷寒沙門氏菌Salmonella typhi（CMCC50071）、宋內(nèi)氏痢疾桿菌Shigella sonnei（ATCC25931）、變形桿菌Proteus（ATCC13315）、產(chǎn)氣桿菌Aerobacter aerogenes（ATCC13049）和糞腸球菌Enterococcus faecalis（ATCC29212），均由本院醫(yī)學中心實驗室保存。

1.2實驗藥品 實驗用鐵棒錘采自甘肅天祝藏族自治縣烏鞘嶺山脈，經(jīng)天祝藏族自治縣藏醫(yī)藥研究所秦寧恩加研究員鑒定為藏藥鐵棒錘，新鮮帶回實驗室，洗凈進行提取。

1.3儀器及試劑 實驗儀器為立式高壓蒸汽滅菌器（YXLS-100S2上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；搖床（ZHWY200B上海智城分析儀器制造有限公司）；數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9272MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DL-4000B冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品）；電子天平（CP124S sartious）；生物安全柜（HFsafe-1200 Hea1 Force）；紫外分光光度計（1810DSPC北京普析通用儀器有限責任公司）。

營養(yǎng)瓊脂（批號20110309-01）及營養(yǎng)肉湯（批號20110215-01）由杭州微生物試劑有限公司提供，無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純。

1.4鐵棒錘水提物和醇提物的制備 取新鮮鐵棒錘200 g，剪碎用研缽研磨，并均分4份，1份按料液比1∶10（g/mL）加入適量去離子水，浸泡30 min后，超聲提取1 h，6 000 r/min，離心15 min，取上清采用醇沉淀除去葉綠素、蛋白質(zhì)等，獲得鐵棒錘水提物。另取3份按料液比1∶10（g/m L）加入適量不同比例乙醇（50%、70%和95%），浸泡30 min后，超聲提取1 h，6 000 r/min，離心15 min，即得鐵棒錘醇提物。真空干燥得褐黃色浸膏，用DMSO溶解，終質(zhì)量濃度為500 mg/mL，通過0.22μm無菌濾器除菌，儲存于4℃冰箱備用。

1.5菌液的制備及濁度測定 取受試菌接種至平板，37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后，經(jīng)染色鏡檢挑取典型菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，以無菌生理鹽水10倍逐次稀釋菌液，并檢測各濃度菌液對應(yīng)的OD600值［9］，選擇相當于0.5倍麥氏標準比濁管菌液濃度作為試驗用濃度。

1.6瓊脂擴散法測定不同提取物的抑菌效果［10-11］取受試菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌菌液0.2mL加入平皿，無菌涂布棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，用直徑6mm無菌打孔器規(guī)則打孔，各孔加入100μL（50 mg/mL）藥液，以硫酸阿米卡星（0.04mg/mL）作為陽性對照，DMSO為陰性對照，將平皿置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24h后觀察并測定抑菌圈的直徑，分析不同提取物的抑菌效果。

1.7熱穩(wěn)定性測試 將定容至50mg/mL鐵棒錘水提取物分別在60、80、100、120℃加熱處理30min，未進行熱處理的相同質(zhì)量濃度的提取物為對照，以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為受試菌，采用瓊脂擴散法測定抑菌活性。

1.8水提物對腸道致病菌的抑菌作用 應(yīng)用分光光度法選擇OD600值為標準數(shù)據(jù)，以營養(yǎng)肉湯為對照校準為零，將7種所測試腸道菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)16h測OD600值；同法接菌至營養(yǎng)肉湯后分別加入不同質(zhì)量濃度提取物（0.5、1.0、2.0、4mg/mL）培養(yǎng)后測OD600值。

1.9最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）及最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）的測定 采用對倍稀釋法測定鐵棒錘水提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的MIC［12］，依次在試管中加入培養(yǎng)基對倍稀釋的藥物0.5mL，各管中藥物的終質(zhì)量濃度為0.05～100.00mg/mL，每管中加入菌液0.1mL混勻，置37℃恒溫培養(yǎng)24h，測定各管OD600值，以無細菌生長管所含最低藥物質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度。以不加藥物（僅加培養(yǎng)基和菌液）管為細菌生長對照管。依據(jù)文獻［13］取0.1mL未見細菌生長的各管培養(yǎng)物涂布于平板，置37℃恒溫培養(yǎng)24h，進行菌落計數(shù)，以菌落數(shù)小于5的最低藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

2　結(jié)果

2.1鐵棒錘水提物和醇提物的結(jié)果 經(jīng)兩種溶劑并輔助超聲波提取均獲得褐黃色浸膏，且水的提取率為35%，醇的提取率為52%，醇的提取率明顯高于水，隨著醇體積分數(shù)增加浸膏提取率基本相同。

2.2菌液濃度比濁度的測定 波長600nm處以分光光度計測得相當于0.5倍麥氏比濁管濁度的菌液OD值為0.09，在濃度為1.5×103cfu/mL～1.5×108cfu/mL范圍內(nèi)，隨著菌液濃度的增加，OD600值增加，兩者間存在線性關(guān)系。且經(jīng)反復測試所有受試菌在第16小時均達到最大菌濃度，此時測量的光密度均為最大值。

2.3兩種溶劑提取物的抑菌效果分析 分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌為受試菌，應(yīng)用瓊脂擴散法測試提取物抑菌作用，結(jié)果顯示水提物對3種受試菌的抑菌圈明顯大于醇提物，而醇提取物抑菌圈大小隨乙醇體積分數(shù)的提高越來越小。3種受試菌分別為G+、G-和芽孢菌，依據(jù)抑菌結(jié)果分析水提物可能具有廣譜抑菌性。結(jié)果見表1。

表1　鐵棒錘水、醇提取物的抑菌效果比較（±s，n=9）

表1　鐵棒錘水、醇提取物的抑菌效果比較（±s，n=9）

注：與陰性對照組比較，**P＜0.01

不同提取物抑菌圈直徑/mm枯草芽孢桿菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌陰性對照組000陽性對照組18±0.2326±0.4222±0.31水提物15±0.57**22±1.34**18±1.19**50%醇提物10±0.63**14±0.48**11±0.59**70%醇提物8±0.349±0.369±0.63 95%醇提物7±0.438±0.217±0.24

2.4熱穩(wěn)定性測定分析 水提取物經(jīng)不同溫度加熱處理后，進行抑菌作用測定，兩種受試菌抑菌圈大小與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可初步表明溫度對鐵棒錘抑菌活性沒有影響，熱穩(wěn)定性好，具有很好的耐熱性。結(jié)果見表2。

表2　鐵棒錘水提取物熱穩(wěn)定性測試（±s，n=9）

表2　鐵棒錘水提取物熱穩(wěn)定性測試（±s，n=9）

注：與陰性對照組比較，*P＞0.05

溫度抑菌圈直徑/mm大腸埃希菌金黃色葡萄球菌陰性對照組22±1.3418±1.19 60℃22±0.68*18±0.63*80℃22±0.46*18±0.56*100℃22±0.52*18±0.38*120℃22±0.39*18±0.43*

2.5鐵棒錘提取物對7種細菌的抑制作用 應(yīng)用分光光度法測不同質(zhì)量濃度水提取物對7種常見腸道致病菌的OD600值，結(jié)果與對照組比較質(zhì)量濃度為0.5、1.0mg/mL的P＜0.05，2.0、4.0mg/mL的P＜0.01，且隨藥物質(zhì)量濃度增加7種受試菌的OD值均不同程度減小，說明藥物對7種受試菌的增殖有明顯的抑制作用，同時對革蘭氏陽性、陰性菌都有抑制作用。結(jié)果見表3。

2.6受試菌對鐵棒錘提取物MIC及MBC的測定結(jié)果 置37℃恒溫培養(yǎng)24h，以無細菌生長管所含最低藥物質(zhì)量濃度即為MIC，依據(jù)文獻［13］以菌落數(shù)小于5的最低藥物質(zhì)量濃度為MBC，結(jié)果見表4和表5。

3　討論

隨著臨床抗感染性疾病抗生素劑量的增加，細菌耐藥性不斷增加，耐藥成為全球性公共健康問題［14］，于是探尋并開發(fā)有效的抗菌藥物目前成為國內(nèi)外抗感染研究的趨勢和熱點［15］。藏醫(yī)藥學是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學寶庫中的瑰寶，具有悠久的歷史和豐富的蘊藏，它是當今世界上獨具特色的民族醫(yī)藥學體系。取材于高原地區(qū)的植物藥材長期生存于高海拔、強日照、大溫差、高寒缺氧的高原地理環(huán)境，孕育了多種特有的次生代謝產(chǎn)物，這將是新藥開發(fā)的潛在先導化合物，是抗菌藥物研究和開發(fā)的新生方向，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表3　不同質(zhì)量濃度鐵棒錘水提取物對腸道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

表3　不同質(zhì)量濃度鐵棒錘水提取物對腸道病原菌的抑制作用（±s，n=9）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

菌株OD600值陰性對照組提取物質(zhì)量濃度/（mg·mL-1）0.51.02.04.0宋內(nèi)氏痢疾桿菌1.079±0.0150.939±0.021*0.685±0.023*0.425±0.016**0.276±0.018**傷寒沙門氏菌1.034±0.0180.882±0.022*0.607±0.024*0.490±0.019**0.202±0.024**產(chǎn)氣桿菌1.294±0.0211.057±0.017*0.736±0.026*0.490±0.018**0.198±0.017**大腸埃希菌1.341±0.0230.925±0.021*0.622±0.013*0.384±0.021**0.135±0.019**糞腸球菌0.990±0.0170.705±0.022*0.623±0.019*0.439±0.015**0.236±0.023**變形桿菌1.714±0.0211.199±0.019*0.997±0.018*0.738±0.023**0.423±0.018**金黃色葡萄球菌1.533±0.0190.879±0.023*0.612±0.029*0.436±0.025**0.278±0.021**

表4　鐵棒錘水提物MIC測定（n=9）

表5　鐵棒錘水提物MBC測定（n=9）

有關(guān)鐵棒錘活性物質(zhì)提取的方法目前文獻資料顯示為傳統(tǒng)煎煮法和乙醇浸漬法萃取，而本實驗應(yīng)用水和不同比例的乙醇做為溶劑并借助超聲波萃取，結(jié)果顯示超聲波水提抗菌物質(zhì)效果明顯優(yōu)于超聲波醇提，而超聲波醇提取隨著醇體積分數(shù)的增加提取效果越來越差，這說明抗菌有效成分為水溶性。經(jīng)反復試驗超聲波水提法是一種操作簡單、萃取工藝成本低、綜合經(jīng)濟效益顯著的方法。

本實驗首次從其清熱解毒的藥理作用方面對藏藥鐵棒錘進行體外抑制常見腸道致病菌活性研究，結(jié)果表明鐵棒錘顯著抑制大腸埃希菌、變形桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的增殖，這表明鐵棒錘具有廣譜抗菌作用。且對以大腸埃希菌、變形桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、傷寒沙門氏菌為代表的G-的抑制效應(yīng)比以金黃色葡萄球菌和糞腸球菌為代表的G+顯著，并在質(zhì)量濃度與抑菌效應(yīng)呈正相關(guān)，此差異性與G+和G-菌的細胞壁結(jié)構(gòu)及化學組成不同有關(guān)［16］。應(yīng)用超過標準大氣壓103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽壓下，溫度達到121.3℃處理30min仍具有較好的抑菌性，說明該抗菌成分熱穩(wěn)定性好，此特性明顯優(yōu)于目前臨床常用的來源于細菌、真菌和放線菌的抗菌藥物，可以通過高壓蒸汽滅菌處理后包裝。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0213-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.048

2014-05-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（ZYZ2012092）

董開忠（1971—），男（藏族），博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物應(yīng)用和病原微生物研究。Te1：（0931）2938150，E-mai1：dkz@xbmu.edu.cn