丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮

丁 霞，　張?jiān)书?，　?云，　鐘凌云

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇　南京　210095；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西　南昌　330004）

丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊總黃酮

丁 霞1，張?jiān)书?，楊 云1，鐘凌云2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京210095；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西南昌330004）

目的 建立雙水相萃取大薊總黃酮的工藝參數(shù)。方法 以丙酮-K2HPO4為雙水相萃取體系，分配系數(shù)K和萃取率Y為考察指標(biāo)，通過(guò)丙酮體積分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量濃度、pH、溫度等單因素分析考察雙水相萃取大薊總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果 其工藝參數(shù)為：丙酮體積分?jǐn)?shù)70%，K2HPO4的質(zhì)量濃度0.24 g/mL，pH 8.0，室溫。在該工藝條件下大薊總黃酮在兩相中的分配系數(shù)達(dá)7.81，萃取得率達(dá)96.8%，黃酮浸膏純度達(dá)89.8%。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可行，操作簡(jiǎn)便快速，廉價(jià)，萃取得率高，可用于分離純化大薊總黃酮。

大薊；總黃酮；雙水相體系

大薊是菊科植物薊Cirsiu japonicum var.Fisch.ex DC.的干燥地上部分，其味甘、苦，性涼，歸心、肝經(jīng)，有涼血、止血、祛瘀、消癰腫的作用［1］。大薊含有多種化學(xué)成分，主要有三萜和甾體類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、長(zhǎng)鏈炔烯醇類(lèi)、黃酮和黃酮苷類(lèi)等化合物。藥理研究顯示大薊黃酮具有抗氧化、止血、抗腫瘤、抗糖尿病等藥理作用［2-4］。

雙水相萃取技術(shù)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相，由于被分離物在兩相中的分配不同，便可實(shí)現(xiàn)分離［5-6］。事實(shí)上，能與水互溶的有機(jī)溶劑在無(wú)機(jī)鹽的存在下也可生成雙水相體系，這種新型的雙水相體系具有價(jià)廉、低毒、易回收且無(wú)需反萃和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的提取分離中已顯示出良好的應(yīng)用前景［7-8］。本實(shí)驗(yàn)采用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取分離大薊總黃酮，探討了丙酮體積分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量濃度、pH以及溫度等單因素對(duì)大薊黃酮在該體系的分配系數(shù)和萃取率的影響，為工業(yè)化利用大薊提供重要依據(jù)。

1　儀器與材料

KQ-500型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器公司）；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；pHS-25型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-200306，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所），大薊（產(chǎn)地安徽，批號(hào)110815），磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮及其他試劑均為分析純。

2　方法

2.1大薊醇提物的制備 精密稱(chēng)取100.0 g大薊，加10倍量體積的石油醚，超聲提取2次，每次30 min。過(guò)濾，揮盡石油醚，殘?jiān)邪戳弦罕?∶8的量加入70%乙醇超聲提取2次，每次30 min。過(guò)濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑得大薊醇提浸膏，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2雙水相體系的制備 在20 mL的具塞試管中加入一定量的丙酮/乙醇、K2HPO4/（NH4）2SO4和水，使體系總體積為20 mL，振蕩2～3 min，靜置，待溶液分相后，讀取上相與下相的體積，計(jì)算V終/V始，V始為有機(jī)溶劑的加入量（mL），V終為成相后有機(jī)相的體積。根據(jù)V終/V始的計(jì)算結(jié)果，評(píng)價(jià)成相行為，確定雙水相體系［9］。

2.3萃取條件的優(yōu)化 在雙水相體系中加入0.15 g醇提浸膏，以分配系數(shù)K和回收率Y為指標(biāo)，考察K2HPO4質(zhì)量濃度、pH、溫度及樣品的加入量對(duì)萃取效果的影響。溶液分相后分別讀取上、下相體積，并取樣分析上、下相中大薊總黃酮的量。按下式計(jì)算黃酮的K和Y：

式中：K為黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù)，ρt、ρb分別為上、下相黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）；Y為黃酮在上相中的萃取率，R為相比，R=Vt/Vb，Vt、Vb分別為上、下相體積（mL）。

2.4總黃酮的測(cè)定［10］

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品21.30 mg置于100 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.213 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL上述對(duì)照品溶液，分別置于25 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，放置6 min；加入10%的硝酸鋁1.0 mL，放置6 min，加入4%氫氧化鈉4.0 mL，加水至刻度，搖勻。在510 nm處測(cè)定吸收值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=8.752 5C-0.017 3，結(jié)果表明大薊黃酮在8.5～51.1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7）。

2.4.2樣品中總黃酮的測(cè)定 吸取上相或下相樣品溶液1.00 mL于25 mL量瓶中，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮的量。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取大薊醇提物0.15 g，按最佳工藝條件進(jìn)行雙水相萃取，讀取上、下相體積，分析上、下相中大薊總黃酮的量，計(jì)算R、K和Y。

2.6總黃酮純化倍數(shù)的測(cè)定 按最佳工藝條件對(duì)大薊醇提浸膏進(jìn)行雙水相萃取，取丙酮相（上相）揮干溶劑，得黃酮浸膏。分別精密稱(chēng)取3份醇提浸膏和黃酮浸膏，配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的供試液，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定黃酮，計(jì)算萃取后黃酮的純化倍數(shù)。

3　結(jié)果

3.1丙酮與K2HPO4加入量對(duì)雙水相成相行為的影響 對(duì)丙酮、乙醇與（NH4）2SO4、K2HPO4進(jìn)行親水有機(jī)溶劑與鹽的兩兩組合的4個(gè)雙水相體系的成相研究，結(jié)果顯示：丙酮-K2HPO4-H2O體系中，V終/V始最趨近于1，且成相速度快，故選擇該體系作為雙水相體系。改變體系中丙酮及K2HPO4的加入量，以V終/V始（V終/V始趨近于1）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察丙酮和K2HPO4加入量對(duì)雙水相成相行為的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1　K2HPO4與丙酮加入量對(duì)雙水相成相行為的影響

由圖1可知，丙酮體積分?jǐn)?shù)（φ丙酮）增大時(shí)，分相所需的K2HPO4的最低量降低，但無(wú)機(jī)鹽的溶解度會(huì)下降。隨著K2HPO4的加入的量提高，V終/V始越趨近于1。在丙酮體積分?jǐn)?shù)φ丙酮=70%時(shí)，K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.20 g/mL，V終/V始趨近于1（＜1.1），有好的成相行為，但K2HPO4的加入量ρ（K2HPO4）＞0.30 g/mL下相黏度顯著增大，分相操作困難。φ丙酮＞70%時(shí)，雖易成相，且V終/V始趨近于1所需的K2HPO4的量更低，但K2HPO4溶解度下降且下相黏度明顯增大。故確定丙酮體積分?jǐn)?shù)（φ丙酮）為70%（V/V），K2HPO4的加入量在0.25 g/mL左右，為萃取大薊總黃酮合適的雙水相體系。

3.2K2HPO4加入量對(duì)雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，改變K2HPO4質(zhì)量濃度（0.20～0.30 g/mL），K2HPO4加入量對(duì)萃取效果的影響如表1所示。由表1可知，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL時(shí)，大薊黃酮有最大的分配系數(shù)和萃取率，故確定K2HPO4的加入量為0.24 g/mL。

表1　磷酸氫二鉀的加入量對(duì)分配系數(shù)及萃取率的影響

3.3pH對(duì)雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，改變體系的pH（8～12），考察pH值對(duì)K和Y的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH越小，K和Y越大，但pH＜8.0時(shí)，下相出現(xiàn)了白色絮狀物，故確定pH=8.0為最佳pH。

表2　pH對(duì)分配系數(shù)及萃取率的影響

3.4溫度對(duì)雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響 φ丙酮= 70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，改變溫度（10～60℃），考察溫度對(duì)雙水相萃取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，當(dāng)溫度＜50℃時(shí)，溫度對(duì)K、Y影響不大，溫度的影響可忽略，故取常溫下（20～30℃）進(jìn)行雙水相萃取即可。

3.5樣品加入量對(duì)雙水相萃取大薊黃酮萃取效果的影響

室溫（25℃）下，φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24 g/mL，pH=8.0，考察醇提浸膏的加入量（0.05～0.50 g）對(duì)黃酮萃取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4所示，醇提浸膏的加入量在2.5～25mg/mL范圍內(nèi)K、Y基本保持不變，符合分配定律。

表3　溫度對(duì)分配系數(shù)及萃取率的影響

表4　樣品加入量對(duì)分配系數(shù)及萃取率的影響

3.6驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 精密稱(chēng)取3份大薊醇提浸膏各0.15 g，按實(shí)驗(yàn)獲得的最佳萃取工藝條件即φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8.0，25℃，在丙酮-K2HPO4雙水相體系中萃取大薊總黃酮，測(cè)定上、下相中黃酮含有量，計(jì)算R、K和Y，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在最佳萃取工藝條件下，在兩相中黃酮的分配系數(shù)平均值為7.81（n=3，RSD=0.5%），丙酮相中黃酮的最大萃取率可達(dá)96.8%（n=3，RSD=0.6%）。

3.7純化倍數(shù) 按照最佳工藝條件萃取大薊黃酮，測(cè)定萃取前后浸膏中總黃酮的量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示萃取前后浸膏中總黃酮的含有量分別為34.6%（n=3，RSD=1.5%）和89.8%（n=3，RSD=2.2%），萃取后浸膏中總黃酮的含有量是萃取前的2.6倍。

4　結(jié)論

4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用丙酮-K2HPO4雙水相體系萃取大薊中的總黃酮，最佳工藝條件為：φ丙酮=70%，ρ（K2HPO4）=0.24g/mL，pH=8，室溫。在最佳工藝條件下大薊黃酮在兩相中的最大分配系數(shù)可達(dá)7.81，上相中最大萃取率達(dá)96.8%。大薊醇提物的質(zhì)量濃度在2.5～25 mg/mL范圍內(nèi)，在兩相中的分配符合分配定律。雙水相萃取后大薊總黃酮純度提高了1.6倍，純度達(dá)89.8%。

4.2雙水相萃取是一種可以不需要使用復(fù)雜設(shè)備，并在溫和條件下進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作就可獲得較高收率的有效成分的新型分離技術(shù)。但在應(yīng)用和研究過(guò)程中仍存在著易乳化、成相聚合物成本較高、水溶性高聚物大多數(shù)黏度較大、不易定量控制，高聚物回收困難等技術(shù)難題。而本實(shí)驗(yàn)中采用丙酮-K2HPO4-H2O體系是基于與水互溶的有機(jī)溶劑和鹽水的雙水相萃取體系，該體系具有溶劑價(jià)廉、低毒、易回收，避免使用高聚物等特點(diǎn)，克服了一般雙水相體系的不足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這種新型的親水有機(jī)溶劑與鹽水組成的雙水相體系萃取大薊黃酮，萃取效果佳、純化倍數(shù)高、操作簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0231-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.053

2013-07-18

江西省對(duì)外科技合作項(xiàng)目（贛財(cái)教［2008］212）

丁 霞（1963—），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效成分。Te1：（025）84396697，E-mai1：dingxia@ njau.edu.cn