白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較

李轉(zhuǎn)梅，　張學(xué)蘭，　李慧芬，　張群群

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟(jì)南　250355）

白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較

李轉(zhuǎn)梅，張學(xué)蘭*，李慧芬，張群群

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355）

目的 定量比較白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸。方法 采用甲醇回流-乙酸乙酯萃取法提取總銀杏酸，用HPLC法測(cè)定白果不同部位（中種皮、內(nèi)種皮、胚乳、胚）及不同炮制品（全白果、白果仁、去皮白果仁、炒白果仁、蒸白果仁、煮白果仁）中白果酸和總銀杏酸。結(jié)果 白果的被測(cè)部位均含有白果酸、白果新酸、十七烷二烯銀杏酸、氫化白果酸和十七烷一烯銀杏酸，白果酸和總銀杏酸的含有量順序?yàn)椋号撸緝?nèi)種皮＞中種皮＞胚乳。白果不同炮制品中白果酸和總銀杏酸含有量順序?yàn)椋喝坠景坠剩救テぐ坠剩局蟀坠剩境窗坠省⒄舭坠?。結(jié)論 通過去皮及加熱炒、蒸、煮制可明顯降低白果中白果酸和總銀杏酸的量。

白果；不同部位；炮制；白果酸；總銀杏酸

白果系我國特產(chǎn)藥材，藥食兼用，具有斂肺定喘，止帶縮尿功能［1］。研究表明，白果具有抗疲勞及延緩衰老的作用［2］，白果清蛋白為其抑菌、抗腫瘤、抗衰老及免疫調(diào)節(jié)作用的有效成分［3-6］。但白果有毒，生食或食用加熱不透的白果達(dá)到一定量時(shí)，可產(chǎn)生毒性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、煩躁不安、昏迷、抽搐、呼吸困難、乃致死亡，種仁與皮膚接觸可引起皮膚局部紅腫發(fā)癢［7］，即使煮熟的白果也不能過多食用。研究顯示，銀杏酚酸類成分具有致敏性、細(xì)胞毒性和免疫毒性［8］，為白果的主要毒性成分，也是銀杏提取物及其制劑中的主要毒性物質(zhì)。目前國際上要求銀杏提取物中銀杏酸含有量應(yīng)控制在5μg/g以下［9］。白果經(jīng)炮制后可降低毒性，供藥用和食用。古今對(duì)白果的炮制方法主要有去殼、去皮心、蒸制、火煨，炒黃、煮熟等，《中國藥典》2010年版收載白果仁和炒白果仁兩種飲片規(guī)格，《全國中藥炮制規(guī)范》1988年版還收載蒸白果仁［10］，《中國藥典》2010年版規(guī)定，銀杏葉提取物中總銀杏酸不得超過10μg/g［1］，但對(duì)白果藥材及其飲片中銀杏酸的限量未作規(guī)定。采用固相萃取-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地白果藥材中總銀杏酸，結(jié)果為67.9～393.6 μg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了安全范圍［11］。用HPLC法測(cè)定大佛指銀杏中銀杏酚酸，結(jié)果以胚芽中含有量最高［12］。對(duì)白果不同部位中的氰氫化物進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)，結(jié)果表明白果中不含氰化物［13］。陳文英等測(cè)定了白果中總黃酮量［14］。但炮制對(duì)白果中銀杏酸的影響未見報(bào)道，目前白果炮制減毒機(jī)理及炮制減毒技術(shù)研究尚屬空白，從而限制了白果的應(yīng)用、新產(chǎn)品的開發(fā)及出口創(chuàng)匯。本研究采用HPLC法定量測(cè)定白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸，為白果飲片的炮制及研制安全有效的白果產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

日立L-2000型高效液相色譜儀（含DAD檢測(cè)器，日本日立公司）；FA1604N型電子天平（十萬分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；PM PLUS型紅外測(cè)溫儀（美國Raytek公司）；多星電炒鍋（淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司）。

白果酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%，批號(hào)111762-200601）；總銀杏酸對(duì)照品（白果酸、白果新酸、十七烷二烯銀杏酸、氫化白果酸、十七烷一烯銀杏酸）中國藥品生物制品檢定所，供鑒別用，批號(hào)111594-200603）；HPLC用甲醇（色譜純）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

碳酸鈉-鹽酸緩沖溶液：精密稱取無水碳酸鈉12.5 g溶解于250 mL蒸餾水中，滴加鹽酸溶液調(diào)pH至2.5。

白果藥材采集自濟(jì)南市長清區(qū)五峰山，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的成熟種子。取鮮白果，除去雜質(zhì)，50℃烘干。

2　方法與結(jié)果

2.1樣品的制備 取凈白果，手工分離其硬殼（中種皮）、膜質(zhì)內(nèi)種皮、胚乳和胚，得中種皮、內(nèi)種皮、胚乳、胚，共4個(gè)不同部位。全白果：取白果藥材，除去雜質(zhì)。白果仁：取全白果，除去中種皮。去皮白果仁：取全白果，除去中種皮和內(nèi)種皮。炒白果仁：取去皮白果仁100 g，置熱鍋內(nèi)，200℃炒至表面深黃色，有裂紋，具香氣。蒸白果仁：取凈白果仁100 g，置籠屜內(nèi)，隔水蒸制4 h，取出，50℃烘干。煮白果仁：取凈白果仁100 g，置鍋內(nèi)，加適量的水煮制4 h，取出，50℃烘干。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白果酸對(duì)照品3.50 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得白果酸對(duì)照品溶液（0.700 mg/mL）。精密稱取總銀杏酸對(duì)照品2.73 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得總銀杏酸對(duì)照品溶液（0.546 mg/mL），作為HPLC定位用。

2.3供試品溶液的制備［12］取各樣品粉末（過三號(hào)篩）約2.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定質(zhì)量，70℃水浴加熱回流3 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用無水甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液30 mL，50℃減壓回收溶劑至干，殘?jiān)犹妓徕c-鹽酸緩沖溶液20 mL混懸，用正己烷萃取3次，每次10 mL，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ萦? mL量瓶中，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4色譜條件 U1timate C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-3%冰醋酸（92∶8）；檢測(cè)波長310 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min。在上述條件下，5種銀杏酸與其他成分均可達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。

圖1　白果酸對(duì)照品（A）、總銀杏酸對(duì)照品（B）、白果內(nèi)種皮（C）HPLC圖譜Fig.1　HPLC chromatograms of ginkgoIic acid reference（A），totaIginkgoIic acids reference（B）and endotheIium endop Ieuraof Ginkgo Semen（C）

2.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取白果酸對(duì)照品溶液0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL，置1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，以進(jìn)樣量Ⅹ（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程Y=558Ⅹ-6.04，r= 0.999 8，線性范圍為0.140～11.2μg。

2.6精密度試驗(yàn) 精密吸取白果內(nèi)種皮供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定白果酸峰面積及5種銀杏酸總峰面積。結(jié)果RSD分別為0.6%和0.7%。表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白果內(nèi)種皮供試品溶液，在室溫下進(jìn)行自然放置，分別在0、2、4、6、8、 12 h精密吸取20μL，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果6次測(cè)得白果酸峰面積的RSD為1.5%，5種銀杏酸總峰面積的RSD為2.0%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn) 取白果內(nèi)種皮粉末（過三號(hào)篩）約2.5 g，共6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算白果酸和總銀杏酸含有量（計(jì)算供試品溶液中與總銀杏酸對(duì)照品相應(yīng)色譜峰的總峰面積，以白果酸對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算總銀杏酸含有量），結(jié)果白果酸平均含有量為170μg/g，RSD為2.1%；總銀杏酸平均含有量為320μg/g，RSD為1.8%。表明方法重復(fù)性較好。

2.9加樣回收試驗(yàn) 取已知含有量的白果內(nèi)種皮粉末（過三號(hào)篩）共6份，每份約2.5g，精密稱定，精密加入白果酸對(duì)照品溶液（0.438mg/mL）1mL，再以甲醇補(bǔ)足至50mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 ResuItsofrecoverytests（n=6）

2.10樣品測(cè)定 精密吸取“2.3”項(xiàng)下白果酸和總銀杏酸對(duì)照品溶液各20μL及供試品溶液適量（中種皮、內(nèi)種皮各20μL，胚2μL，其余均為40 μL），注入液相色譜儀，依法測(cè)定，并計(jì)算樣品中白果酸和總銀杏酸的量，結(jié)果見表2。

表2　樣品測(cè)定結(jié)果（n=2）Tab.2 ResuItsofsampIedetermination（n=2）

3　小結(jié)與討論

3.1研究表明，白果的中種皮、內(nèi)種皮、胚乳及胚中均含有白果酸、白果新酸、十七烷二烯銀杏酸、氫化白果酸和十七烷一烯銀杏酸，以白果酸含有量最高。在白果不同部位中，以胚中白果酸和總銀杏酸的量最高，其次是內(nèi)種皮和中種皮，胚乳中的量最低。白果胚、內(nèi)種皮和中種皮中總銀杏酸的量分別是胚乳的597.5、34.7和26.5倍，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，而胚乳中總銀杏酸的量接近安全范圍，說明白果傳統(tǒng)炮制時(shí)去殼和去皮心的操作是有其科學(xué)道理的。研究提示，對(duì)白果加工產(chǎn)品的研發(fā)途徑之一可將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到可食部分（胚乳）的利用。

3.2目前白果及銀杏葉提取物中白果酸的提取方法有石油醚回流提?。?］、甲醇回流提?。?1］等方法。經(jīng)對(duì)提取溶劑甲醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯進(jìn)行比較，結(jié)果以甲醇為溶劑，提取效果最佳。對(duì)提取方法甲醇回流3h和甲醇超聲0.5h、1h進(jìn)行比較，結(jié)果以甲醇回流3h提取量最高。白果中銀杏酸含有量低，測(cè)定時(shí)取樣量大，甲醇提取液中含有較多的內(nèi)酯類、色素類等雜質(zhì)，干擾測(cè)定，且損害色譜柱的使用壽命，故需進(jìn)一步純化，本研究參考文獻(xiàn)［15］采用正己烷萃取法，加入pH2～3的碳酸鈉-鹽酸緩沖溶液將銀杏酸充分轉(zhuǎn)移到正己烷相中。同時(shí)對(duì)檢測(cè)波長、流動(dòng)相等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，該方法靈敏可靠、重復(fù)性好，可用于白果炮制品的定量測(cè)定。

3.3白果不同炮制品中白果酸和總銀杏酸比較表明，去皮及加熱炒、蒸、煮制均可明顯降低白果中白果酸和總銀杏酸的量，從而降低毒性，但就炒、蒸、煮三種方法而言，炒法溫度高，炒制時(shí)間短，去毒效果好，而蒸和煮法炮制時(shí)間長，且在蒸制和煮制過程中炮制品變色嚴(yán)重。

3.4《中國藥典》2010年版收載的炒白果仁要求取全白果仁（帶內(nèi)種皮）炒制，而本實(shí)驗(yàn)是取除去內(nèi)種皮的白果仁炒制，這是因?yàn)榘坠麅?nèi)種皮呈膜質(zhì)，質(zhì)地松泡，在炒制時(shí)極易脫落而焦糊，嚴(yán)重影響成品外觀質(zhì)量，而去皮后炒則可克服此弊端，且去皮后炒制品中白果酸和總銀杏酸的量明顯低于藥典法炮制品。后期將進(jìn)一步優(yōu)化炒白果的工藝技術(shù)參數(shù)，并探索建立新的去毒工藝。

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Quantitative com parison of ginkgoIic acid and totaIginkgoIic acids in different parts and processed products of Ginkgo semen

LIZhuan-mei， ZHANG Xue-1an*， LIHui-fen， ZHANG Qun-qun
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

AIM To quantitative1y compare the contents of ginkgo1ic acid and tota1ginkgo1ic acids in different parts and processed products of Ginkgo semen.METHODS Methano1 ref1ux and acetate acid were app1ied to the extraction of tota1ginkgo1ic acids，the determination was perfomed on HPLC of the constituents in different parts（mesosperm，endothe1ium endop1eura，endosperm，embryo）and processed products（ho1o-ginkgo semen，kerne1of ginkgo semen，pee1ed kerne1of ginkgo semen，scramb1ing pee1ed kerne1of ginkgo semen，steaming pee1ed kerne1of ginkgo semen，cooking pee1ed kerne1 of ginkgo semen）.RESULTS The measured parts contained ginkgo1ic acid，ginkgoneo1ic acid，hetadecy1-dienoic ginkgo1ic acid，hydroginkgo1ic acid and hetadecy1-enoic ginkgo1ic acid in the order of content，embryo＞endothe1ium endop1eura＞mesosperm＞endosperm.In the order of processed products，ho1o-ginkgo semen＞kerne1 of ginkgo semen＞pee1ed kerne1 of ginkgo semen＞cooking pee1ed kerne1 of ginkgo semen＞scramb1ing pee1ed kerne1 of ginkgo semen，steaming pee1ed kerne1 of ginkgo semen.CONCLUSION The resu1ts show that the method of pee1ing，hot frying，steaming and boi1ing can remarkab1y decrease the contents of ginkgo1ic acid and tota1ginkgo1ic acid in Ginkgo semen.

Ginkgo semen；parts；processing；ginkgo1ic acid；tota1ginkgo1ic acids

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0164-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.035

2014-01-19

濟(jì)南市高校自主創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（201303027）

李轉(zhuǎn)梅（1989—），女，碩士生，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Te1：15275172822，E-mai1：1058794709@ qq.com

張學(xué)蘭（1963—），女，碩士，教授，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制研究。Te1：13406062766，E-mai1：zhang8832440@sina.com